[发明专利]一种蛋白质的表达方法

说明书

本发明提供了一种蛋白质的表达方法，使用无血清无动物源性培养基，采用基础培养基和补充培养基进行蛋白质类药物的大规模生产表达，基础培养基适用于细胞扩增和灌流培养，补充培养基适用于补充批次培养，该方法所表达的蛋白质药物不含有非人源糖基化。

技术领域

本发明名为分案申请，原案申请号为2019114049586。

本发明属于生物技术领域，具体地，本发明涉及一种蛋白质的表达方法，更具体地本发明涉及一种蛋白质药物的CHO细胞表达方法，所表达的蛋白质药物不含有非人源糖基化。

背景技术

在蛋白质翻译后的修饰中，糖基化修饰是最重要和最复杂的修饰之一，也是评价蛋白质类药物，如抗体药物质量的关键属性之一。

蛋白质药物的功能实现与其糖基化修饰密切相关，糖基化修饰会影响蛋白质药物的性能，如构象、稳定性、溶解度、药物代谢动力学、活性及免疫原性等等。

根据糖基化修饰的位点可以将糖基化分为N位糖基化和O位糖基化，N位糖基化位于Asn-297，寡糖中的N-乙酰氨基葡萄糖与天冬酰胺残基上的酰胺氮连接修饰蛋白质；O位糖基化由寡糖中的N-乙酰半乳糖与丝氨酸或苏氨酸残基上的羟基连接修饰蛋白质。

动物细胞表达系统所表达的免疫球蛋白中N位的糖基化是最普遍的糖基化修饰，其糖基化修饰位点位于抗体的Fc端，且根据其末端的结构的不同又可分为复合型、杂合型和高甘露糖型。复合型其糖基化以岩藻糖（Fuc）为核心，再由N-乙酰氨基葡萄糖（N-GlcNAc）分出两条等长的分支，其分支上伴以甘露糖（Man）、半乳糖（Gal）和唾液酸（Sia），由此构成抗体Fc端N位糖基化。根据两条分支中的单糖不同，可将抗体糖基化修饰类型分为G0F、G1F、G2F、G1FS、G2S1F、G2S2F、G0、G1、G2（Fcglycans of therapeutic antibodies as criticalquality attributes）。

不同的糖基化修饰对蛋白质类药物的稳定性和半衰期、安全性及生物活性具有不同的影响。糖基化修饰可以增加蛋白质类药物的稳定性及溶解度。但是，糖基化的存在也会对蛋白质类药物的安全性造成影响，蛋白质类药物糖基化的存在，会影响其施用时的免疫原性，也会对蛋白质类药物的药物代谢动力学及药效动力学产生影响；抗体类药物的糖基化位点往往也是抗体Fc受体（ADCC机制）和C1q（CDC机制）的结合位点，也会影响抗体的生物活性（Engineeredtherapeutic antibodies with improved effector functions）。

以单克隆抗体为例，糖基化修饰形成的糖链结构能够维持抗体的空间构象、稳定抗体的结构，抗体脱糖基化后对热的稳定性大大降低，糖链结构还能保护抗体不受某些蛋白酶水解。糖链中特别的糖型还与免疫相应功能密切相关，非人源的糖基化，其糖型并非在人体内生物合成，这些非人源的糖基化会具有一定的免疫原性，可加速单克隆抗体的血浆清除。

糖基化中的唾液酸化作用，在哺乳动物细胞表达系统中主要存在两种类型，分别是N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac，NANA），N-羟乙基神经氨酸（Neu5Gc，NGNA）。正常情况下，人类的IgG中含有的唾液酸化类型是Neu5Ac（NANA），而小鼠的IgG中含有的唾液酸化类型是Neu5Gc（NGNA）。

在蛋白质大规模生产所使用的哺乳动物细胞表达系统中也会产生Gal-α（1,3）-Gal（α-Gal）的糖基化结构，α-Gal（α-半乳糖）是一种非人源的聚糖，具有极强的免疫原性，会引发异体移植中的组织排斥反应，NK细胞能够直接识别该聚糖，若存在高水平的抗α-GalIgE抗体，使用含有α-Gal聚糖结构的单克隆抗体进行治疗，则会引起严重的超敏反应。

目前现有蛋白质类药物的大规模生产多是采用动物细胞培养，使用动物细胞大规模培养单克隆抗体、免疫调节因子、特定肿瘤抗原以及各种基因重组的蛋白质类药物。动物细胞同微生物相比具有转录后修饰的功能，能够更高效地表达和生产各类高质量的蛋白质类药物。