[发明专利]一种双启动子表达载体及其构建方法

说明书

本申请属于基因工程技术领域，具体涉及一种能同时在原核及哺乳动物细胞中分别表达目的基因的双启动子表达载体及其构建方法。该载体以真核表达载体为出发载体，同时基因组中包含有原核启动子T7序列、核糖体结合位点和T7终止序列。本申请所构建的双启动子表达载体，能在原核和真核细胞中同时表达同一目的基因，可克服现有同一目的蛋白在哺乳动物及原核细胞需要2套表达系统的繁杂步骤，也为相关目的基因在不同表达系统中表达奠定一定技术基础。

技术领域

本申请属于基因工程技术领域，具体涉及一种能同时在原核及哺乳动物细胞中分别表达目的基因的双启动子表达载体及其构建方法专利申请。

背景技术

基因工程技术常规应用中，通过将人为获取的外源目的基因与载体在体外进行重组，然后将重组载体导入到受体细胞并使该目的基因在受体细胞中进行正常的复制、转录和翻译，进而可对目的基因功能进行深入分析和研究。基于这一原理，基因工程技术在医药学领域已经得到广泛应用，如生产重组蛋白药物、基因治疗等。

现有技术中，利用基因工程进行重组蛋白药物生产时，依据受体细胞基因组差异，可将蛋白表达系统分为两类：真核表达系统和原核表达系统，其中真核表达系统如哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞等；原核表达系统如大肠杆菌等。其中哺乳动物和大肠杆菌表达系统是现有重组蛋白药物制备中最为常用和最为主要的表达系统。统计表明，现有80%以上批准上市的重组蛋白药物是在这两个表达系统生产的。

现有技术中，用于表达重组蛋白的哺乳动物细胞主要包括：中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovarian cells，CHO）细胞、小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0和NS0、人胚胎肾细胞HEK293、仓鼠肾细胞BHK-21等。而原核表达系统中的大肠杆菌因其遗传背景清楚，具有相对于CHO细胞其表达量较高、能在培养基上快速繁殖、成本低等优点，因此以大肠杆菌构建的蛋白表达系统是最常用的原核表达系统。

由于现有原核、真核两个表达系统在表达蛋白时，针对目的基因进行有效复制、选择、转录以及翻译所需的元件不同，因此若想在这两个系统中表达相同的蛋白往往需要针对性选择或设计不同的重组表达载体。而这个过程由于操作步骤较为繁琐、成本较高。

发明内容

本申请目的在于提供一种同时包含真核启动子CMV和原核启动子T7的双启动子表达载体，从而可以在真核细胞或原核细胞中表达相同目的基因，从而为相关基因研究或目的蛋白制备奠定一定技术基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

一种双启动子表达载体，其基因组中包含有原核启动子T7序列、核糖体结合位点RBS和T7终止序列；具体构建时，以pIRES-neo、pIRES-neo2、pIRES-neo3、pEGFP-C1、pcDNA1.1、pCHO1.0等真核表达载体为出发载体，利用基因工程技术构建获得；

所构建的双启动子表达载体中，T7启动子序列位于真核表达载体的启动子（真核启动子例如为：SV40、CMV、EF1α、CAG等）下游，核糖体结合位点位于T7启动子序列下游，T7终止序列位于出发载体的真核表达载体筛选标记（例如新霉素磷酸转移酶（neomycinphosphotransferase，NPT）抗性基因）下游；

具体构建时，通过将启动子T7序列、核糖体结合位点（RBS）和T7终止序列或者启动子T7序列与核糖体结合位点（RBS）的连接序列、T7终止序列重组至真核表达载体构建获得；

所述启动子T7序列为：TAATACGACTCACTATA，

所述RBS序列为：GAAGGA；