[发明专利]一种呕吐毒素荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种呕吐毒素荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用。试纸条包括底板，底板上贴有反应膜；反应膜的一端覆盖吸水垫，另一端依次覆盖结合垫和样品垫；反应膜的非覆盖面上沿横向设置有检测线和质控线；结合垫上喷涂有聚集诱导发光荧光微球标记的呕吐毒素单克隆抗体的荧光探针；检测线上包被有呕吐毒素完全抗原，质控线上包被有山羊抗鼠二抗抗体。本发明大大简化了标记步骤，提高了标记效率，缩短了检测时长，比胶体金物理吸附稳定性好，检测准确度和精密度高；批次间差异性小成本低；另外检测方法操作简单，整个检测过程仅需要8min，检出限100ppb，定量检测范围100ppb～5000ppb，灵敏度高和特异性强。

技术领域

本发明属于免疫检测领域，尤其涉及饲料与谷物产品中快速测定检测呕吐毒素技术领域。更具体地，涉及一种呕吐毒素荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用。

背景技术

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，缩写DON)是一种常见的B型单端孢霉烯族毒素，是单端包菌素烯烃中的一种，它通常由谷类物品(如小麦、玉米和大麦等)中的霉菌、镰红菌素生成。大剂量的呕吐毒素可引发人、猪、反刍动物、小鼠以及家禽等出现呕吐症状，故又俗称为“呕吐毒素”，可使人和动物体重减轻，腹泻，扰乱肠道系统的稳态、并影响内分泌系统及免疫系统等，并能通过血液循环到达血脑屏障，从而造成潜在的神经毒性。DON抑制蛋白质的合成、细胞的增殖，从而可能导致基因毒性、细胞毒性等。其中，雄性动物对DON更为敏感。猪是对DON最敏感的动物，当饲料中DON浓度达到1～2ppm就会使采食量降低(Prelusky et al.,1994)。

DON固体是无颜色的针状结晶，熔点大约为151～153℃左右，闪点为-3℃，储存条件为2～8℃，应与食品原料分开存放。DON具热稳定性，能耐170～350℃的高温，并耐酸碱，在低压条件下其结构很难破坏，只有在高压或加碳酸钠等碱性条件下才能破坏大量毒性，通常呕吐毒素贮藏四至五年后，其毒性仍能保留。研究表明，呕吐毒素可能对免疫系统有影响，有明显的备胎毒性和一定的致畸作用。由于呕吐毒素的危害严重，引起了各国的普遍重视。中国、巴西、美国、阿根廷和南非等世界各地均有DON污染粮食的报导。2016年在中国山东调查了359份面粉样品的霉菌毒素污染状况，发现DON的检出率最高，达到97.2％，平均污染浓度为86.7μg/kg(Li et al.,2016)。不仅在粮谷作物中DON的污染严重，在饲料原料及全价配合饲料中的污染也很普遍。2012～2014年，随机收集的我国中部地区饲料及配合饲料190份，DON的阳性率为77.4％(Liu et al.,2016)。因此，谷物及饲料中对呕吐毒素的含量均有严格的限量标准。我国谷物、猪配合饲料、犊牛配合饲料和泌乳期动物配合饲料中呕吐毒素的限量标准为1.0mg/kg，而牛配合饲料和家禽配合饲料中呕吐毒素的限量标准为5.0mg/kg。

目前检测呕吐毒素的方法有很多种，如薄层色谱法、酶联免疫吸附法(ELISA)、气相色谱、高效液相色谱法、紫外线光谱分析法和胶体金免疫层析法。其中，仪器法灵敏、准确、但需要昂贵的仪器、样品的前处理复杂、繁琐费时、检测成本较高、而且需要专业人员操作，从而限制了其应用。中国专利文献CN 101413954 A公开了一种呕吐毒素的酶联免疫吸附检测专用测试盒及制备及检测方法。但诸如酶联免疫分析、化学发光免疫分析等传统免疫分析方法，虽然简单，但灵敏度较差又比较，另外其检测流程仍需实验室条件保障，检测操作依旧需要专业人员进行，一般仍需要利用酶标仪等较为大型的专业仪器进行辅助检测，且很难单份操作，在没有条件开展实验室检测的边远地区或基层医疗机构中，该方法是不利于粮食和饲料的及时检测和大面积筛查的。