[发明专利]一种YAP1基因修饰的间充质干细胞及其制备方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，旨在提供一种YAP1基因修饰的间充质干细胞及其制备方法。该间充质干细胞是以过表达YAP1基因修饰的原代间充质干细胞，其中YAP1基因来源于YAP1慢病毒载体或YAP1质粒载体，原代间充质干细胞的来源是下述任意一种人体组织：胎盘、脐带或脂肪组织。本发明获得的YAP1基因修饰的间充质干细胞，不影响MSC本身表型和分化能力；通过利用过表达YAP1基因修饰间充质干细胞，本发明可以显著促进间充质干细胞的增殖，进一步提高细胞的产量；因此能够快速获得大量的间充质干细胞用于临床干细胞移植治疗。

发明领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种YAP1基因修饰的间充质干细胞及其制备方法。

背景技术

在再生医学和临床治疗中，由于间充质干细胞(MSCs)具有自我更新和多系分化的能力，它们已成为胚胎干细胞最有希望的替代物。近年来，陆续有临床前和临床研究证明了间充质干细胞对于免疫性疾病、心肌损伤、肝脏疾病、肺损伤、肾脏疾病和糖尿病等有明显的治疗作用。MSCs可从多种组织中分离获得，如：骨髓、胎盘、脂肪组织、滑膜组织、肺组织、脐带血、外周血等。但是，先前的研究表明，无论间充质干细胞的来源如何，单次植入细胞治疗肝病的最佳数量约为1-5×10⁷。考虑到临床间充质干细胞移植治疗需要大量的细胞数目以及从组织获得的间充质干细胞的初始数量很少，原代间充质干细胞需要在体外进行广泛扩增才能满足临床治疗的输注数量级。因此如何快速的获得可用于临床细胞移植的细胞数一直是再生医学的研究热点。

间充质干细胞的增殖能力受许多因素影响，包括来源的个体及组织、培养的条件和持续的传代的影响。未加基因修饰的间充质干细胞在体外增殖的速率较慢，扩增到临床应用数量级所需时间较长。因此，寻找和克隆表达调控间充质干细胞增殖能力的相关基因，不仅有助于推动间充质干细胞的产业化，还有助于其在临床治疗上的广泛应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种YAP1基因修饰的间充质干细胞及其制备方法，以满足临床细胞移植对于大量细胞数的要求。

为解决技术问题，本发明的解决方案是：

提供一种YAP1基因修饰的间充质干细胞，是以过表达YAP1基因修饰的原代间充质干细胞。

本发明中，所述YAP1基因来源于YAP1慢病毒载体或YAP1质粒载体。

本发明中，所述原代间充质干细胞的来源是下述任意一种人体组织：胎盘、脐带或脂肪组织。

本发明进一步提供了前述YAP1基因修饰的间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：

(1)取含有原代间充质干细胞的胎盘、脐带或脂肪组织，剪取小块；在培养皿上用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)清洗至清洗液透明后，充分剪碎；

(2)将剪碎的组织块转移至50毫升离心管内，加入25毫升质量/体积浓度为0.1％的胶原酶Ⅳ，放在37℃恒温的摇床上摇晃消化30分钟；

(3)向消化好的组织中加入20毫升磷酸盐缓冲液，混匀后经100微米筛网过滤；将滤液在1200转/分钟离心5分钟，去上清液保留细胞沉淀；

(4)向细胞沉淀中加入5毫升含有20％胎牛血清的DMEM培养基，混匀后接种至T25培养瓶；然后置于5％CO₂、37℃恒温的培养箱中；每隔3天换一次新鲜的含有20％胎牛血清的DMEM培养基；

(5)待细胞50％汇合后，以感染复数为50∶1加入YAP1慢病毒载体或YAP1质粒载体，转染间充质干细胞；完成转染后得到过表达YAP1基因修饰的原代间充质干细胞YAP1-LV-MSC。

所述的基因修饰的间充质干细胞在细胞扩增上的应用，特征在于通过基因修饰增加YAP1基因编码的蛋白的表达量，提高间充质干细胞增殖率。