[发明专利]一种用于诊断FHT/MP/HPS三重PCR试剂盒及其检测方法

说明书

本发明属于动物医学动物疫病分子生物学诊断领域，公开了一种用于诊断FHT/MP/HPS三重PCR试剂盒及其检测方法，该试剂盒包括3对特异引物，FHT‑F/FHT‑R为猪附红细胞体特异性扩增引物组，MP‑F/MP‑R为猪肺炎支原体特异性扩增引物组，HPS‑F/HPS‑R为副猪嗜血杆菌特异性扩增引物组；能从患病猪的病料中扩增相应的特异性基因组片段，一次检测即可确诊猪附红细胞体、猪支原体肺炎、副猪嗜血杆菌这三种病原的单一感染或混合感染，且试剂盒检测灵敏度高、特异性好、稳定性高、结果直观，其检测方法易于操作、方便快捷，能大幅缩短检测时间，为临床控制感染提供技术支持。

技术领域

本发明涉及动物医学动物疫病分子生物学诊断领域，具体涉及一种用于诊断FHT/MP/HPS三重PCR试剂盒及其检测方法，用于猪附红细胞体、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌的检测。

背景技术

猪附红细胞体可引起猪群发热、贫血和黄疸，近年该病在猪场普遍性感染，给养猪业造成较大的经济损失。研究认为垂直传播和血源传播是感染附红细胞体的主要途径。附红细胞体在体外不能纯培养，因而对猪附红细胞体病的诊断困难。现有通过镜检进行诊断误诊率较高，提高诊断的准确性和特异性，需要借助分子生物学技术。

猪支原体肺炎又称猪地方流行性肺炎，俗称猪气喘病，是由猪肺炎支原体引起猪的一种慢性呼吸道传染病。主要症状为咳嗽和气喘，病变的特征是肺的尖叶、心叶、中间叶和膈叶前缘呈肉样或虾肉样实变。病原体为猪肺炎支原体，属支原体科、支原体属成员。因无细胞壁，故是多形态微生物。猪支原体肺炎营养要求很高，病原分离培养难度大，耗时长，不适合临床快速诊断。

副猪嗜血杆菌是猪上呼吸道中常在的一种机会致病菌，在特定条件下能够侵入机体，引发以纤维素性多发性关节炎、脑膜炎和浆膜炎为主要特征的全身性疫病，是目前影响养猪业最严重的病原之一。副猪嗜血杆菌病死亡率较高，病发后不易治愈，病死率高达50％。该病传染性强，严重危害仔猪和青年猪的健康。该病在我国已呈现出流行趋势，给养猪业带来了巨大的经济损失。为此，建立早期快速检测方法对副猪嗜血杆菌感染的预防和控制具有十分重要的意义。传统的细菌分离和血清学检测方法，存在耗时长、对检测人员技术要求高、操作复杂以及敏感性差等诸多不足。

随着分子诊断技术的成熟与普及，PCR技术以其快速、敏感、易于操作等优点在动物疫病诊断中得到了广泛应用。以上三种疫病病原均属于难培养或尚无法培养的病原微生物，研究者也建立了相关病原的PCR诊断方法，但是没有见到三重PCR检测技术的开发报道，因此，发明一种快速鉴别FHT/MP/HPS感染的诊断试剂盒，为临床快速确诊相应疾病，具有重要的现实意义。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种用于诊断FHT/MP/HPS三重PCR试剂盒及其检测方法，该试剂盒参照GenBank已发表的猪附红细胞体、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌基因序列，设计3对特异引物，能从患病猪的病料中扩增相应的特异性基因组片段，一次检测即可确诊猪附红细胞体、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌这三种病原的单一感染或混合感染，且试剂盒检测灵敏度高、特异性好、稳定性高、结果直观，其检测方法易于操作、方便快捷，能大幅缩短检测时间，为临床控制感染提供技术支持。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现。

(一)一种用于诊断FHT/MP/HPS三重PCR试剂盒，包括裂解液、扩增反应混合液、阴性对照和阳性对照；其中，所述裂解液的成分为DNAiso Reagent；所述扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、PCR Buffer、dNTP、FHT-F上游引物、FHT-R下游引物、MP-F上游引物、MP-R下游引物、HPS-F上游引物、HPS-R下游引物和rTaq DNA聚合酶；所述阴性对照为灭菌三蒸水；所述阳性对照为猪附红细胞体、猪肺炎支原体和副猪嗜血杆菌阳性质粒混合物。

优选的，FHT-F上游引物序列为：5’-TAACTTACTTATCTGAGGAA-3’