[发明专利]实时荧光PCR检测葡萄白粉病菌潜育期侵染量的方法

权利要求书

1.一种实时荧光PCR检测葡萄白粉病菌潜育期侵染量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤1：准备样品菌株，包括葡萄白粉病菌、芸薹链格孢、哈茨木霉和辣椒胶胞炭疽菌；

步骤2：对菌株进行样品DNA提取；

步骤3：设计并合成引物；

步骤4：对引物进行特异性检查；

步骤5：优化Real-time PCR反应退火温度；

步骤6：制备质粒标准品；

步骤7：绘制Real-time PCR标准曲线并进行有效性检验；

步骤8：通过Real-time PCR定量检测接种后叶片中病原菌含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2中样品DNA提取包括以下步骤：

步骤2.1：取1.5mL离心管加入400μL LE Buffer；取葡萄白粉病菌丝0.5g放入液氮中充分研磨后加入离心管中混匀；

步骤2.2：于65℃环境中温浴15～30min；加入130μL DA Buffer混匀后冰浴5min，14,000r离心3min；

步骤2.3：将上清液转移到新的1.5mL离心管，加滤液体积1.5倍的E Binding Buffer混匀然后转移至过滤柱，6,000r离心1min，弃废液；

步骤2.4：向柱子中加入500μL的G Binding Buffer，10000r离心30s，弃废液；

步骤2.5：过滤柱中加入600μL的Wash Buffer，10000r离心30s，弃废液；

步骤2.6：重复上一步骤一次；再次将柱子10000r离心1min后转移至新的1.5mL离心管；加入150μL Elution Buffer，并于室温温育1min；12000r离心1min，弃去过滤柱；

步骤2.7：分装DNA，标记，-20℃保存备用。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3具体为：利用葡萄白粉病菌ITS序列设计特异性引物UNF2/UNR2，目的片段大小为157bp,葡萄白粉病菌ITS序列全长1323bp；

所述UNF2：5’-CCTCAAGCTGCCCTTGTG-3’；

所述UNR2：5-’TCCGGATGACCGGACAA-3’。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤4具体为：将步骤2中提取的样品DNA以ddH₂O为空白对照，用步骤3中引物UNF2/UNR2进行常规PCR和Real-time PCR扩增，检测引物特异性。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述Real-time PCR扩增及检测引物特异性具体为：94℃预变性30s；94℃变性5s；58℃退火15s；72℃延伸30s；40个循环；使用荧光定量PCR仪进行扩增，并对扩增加结果进行数据分析，获取Real-time PCR对引物UNF2/UNR2溶解曲线；分析温度设定为60～95℃之间，每0.5℃收集荧光信号30s，溶解曲线分析中有单一特异的峰为判断引物特异性的标准。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤5具体为设计退火温度区间56～59℃，优化退火温度按Real-time PCR反应体系及条件，对扩增曲线和溶解曲线中荧光值△Rn最高和Ct值最小且在溶解曲线分析中有单一吸收峰为标准，进行最佳退火温度的优化，Ct值为每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历等的循环数。