[发明专利]实时荧光PCR检测葡萄白粉病菌潜育期侵染量的方法

说明书

本发明提供一种实时荧光PCR检测葡萄白粉病菌潜育期侵染量的方法，本发明依据葡萄白粉病菌ITS基因组序列（1323 bp），设计葡萄白粉病菌的特异性引物，构建了葡萄白粉病菌Real‑time PCR分子检测体系；通过人工接种的方法，建立了潜育期葡萄叶片葡萄白粉病菌菌源量与接种时间的关系。通过本发明，构建了早期、快速、准确、灵敏的定量检测葡萄白粉病菌的Real‑time PCR方法，为葡萄白粉病的早期预防和防治措施的制定提供理论依据。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种实时荧光PCR检测葡萄白粉病菌潜育期侵染量的方法。

背景技术

葡萄白粉病是由葡萄钩丝壳菌Uncinula necator(Schw.)Burr.引起的一种真菌病害。起源于欧洲，现几乎遍布世界所有葡萄产区。葡萄白粉病的流行会严重影响葡萄树势、产量和品质。在流行年份，一般减产30％左右，严重时减产达50％以上。而国内尚未见有关葡萄白粉病Real-time PCR早期预警检测方面的发明，就目前传统的预测模式，根本检测不到葡萄白粉病菌潜育期的发病情况，从而影响该病的早期防治，错过防治关键期，造成严重的经济损失。因此，建立葡萄白粉病的Real-time PCR体系，为葡萄白粉病菌的早期检测提供理论和技术支撑尤为迫切。

国内外发明中，Chellemi和Marois采用微机处理系统成功的研制出用于预测葡萄白粉菌生长的生长模型，此模型可以预测预报和监控白粉病菌的生长。Diaz等认为通过对空气中传播的病原体进行空气生物学发明可以预测在生产季节病害的潜在风险，从而为葡萄白粉病的适期防治提供科学指导。近年来，随着分子技术的快速发展，尤其是实时荧光定量PCR技术，因其具有定量准确、快速、特异性强、灵敏度高、操作简便等优点而受到人们的青睐，从而使得对植物病害的早期监测成为可能，并逐步开始应用于病害的早期诊断发明。闫佳会等采用Real-time PCR的方法，定量检测对小麦条锈菌进行了检测。陈兆贵等利用Real-time PCR的方法，用特异性引物对马铃薯卷叶病毒进行了定量发明。在白粉病菌的定量发明方面，郑亚明^[14]对小麦叶片中潜伏侵染白粉菌的Real-time PCR检测技术进行了发明。目前国内外主要开展了葡萄白粉病菌检测、鉴定和分子标记等方面的发明，尚未见有关葡萄白粉病菌Real-time PCR早期定量检测方法的报道。

发明内容

为了解决上述问题，本发明依据葡萄白粉病菌ITS基因组序列(1323bp)，设计葡萄白粉病菌的特异性引物，构建了葡萄白粉病菌Real-time PCR分子检测体系；通过人工接种的方法，建立了潜育期葡萄叶片葡萄白粉病菌菌源量与接种时间的关系。通过本发明，构建了早期、快速、准确、灵敏的定量检测葡萄白粉病菌的Real-time PCR方法，为葡萄白粉病的早期预防和防治措施的制定提供理论依据。

进一步地，本发明提供一种实时荧光PCR检测葡萄白粉病菌潜育期侵染量的方法，所述方法包括以下步骤：

步骤1：准备样品菌株，包括葡萄白粉病菌、芸薹链格孢、哈茨木霉和辣椒胶胞炭疽菌；

步骤2：对菌株进行样品DNA提取；

步骤3：设计并合成引物；

步骤4：对引物进行特异性检查；

步骤5：优化Real-time PCR反应退火温度；

步骤6：制备质粒标准品；

步骤7：绘制Real-time PCR标准曲线并进行有效性检验；

步骤8：通过Real-time PCR定量检测接种后叶片中病原菌含量；

进一步地，所述步骤2中样品DNA提取包括以下步骤：

步骤2.1：取1.5mL离心管加入400μL LE Buffer；取葡萄霜霉菌丝0.5g放入液氮中充分研磨后加入离心管中混匀；