[发明专利]一种四环素类抗生素降解基因tet(X)的优化及其在真核表达系统中的应用

说明书

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种四环素类抗生素降解基因tet(X)的优化及其在真核表达系统中的应用，为构建一种可分泌四环素类抗生素降解酶的真核表达系统，从而为四环素类抗生素的降解提供了一种新的途径，本发明在基因tet(X)序列的基础上经过优化得到适用于真核表达系统的tet(X)^*序列，并首次使用pPIC9K载体将优化后的基因稳定的转入到毕赤酵母GS115中，构建得到一种工程酵母，该工程酵母具有表达Tet(X)蛋白的能力。通过工程酵母的表达效果试验可见，该工程酵母外源基因所表达的蛋白质在NADPH、Mg²⁺、O₂的参与下表现出生物功能，对四环素类抗生素具有高效的降解作用。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种四环素类抗生素降解基因tet(X)的优化及其在真核表达系统中的应用。

背景技术

四环素类抗生素包括四环素、土霉素、金霉素等，是一类广谱抗生素，被广泛应用于人类及动物疾病的防治，同时也被作为饲料添加剂应用于禽畜养殖业和水产养殖业中。四环素类抗生素结构复杂，含并四苯骨架，属于难生物降解物质，很容易在环境中富集，在动物体内，四环素仅有部分被吸收并发生代谢，大部分以活性形式(母体或代谢产物)随粪便和尿液排出体外，进入生态环境。目前，四环素类抗生素在家畜和人群中均使用广泛，因其较低的吸收率导致四环素类抗生素的残留问题十分严峻，四环素类抗生素的残留对环境、家畜和人类健康发展均造成重大威胁。当前，降解四环素类抗生素的方式主要有以下两种：一是生物降解，包括微生物降解和植物降解；二是非生物降解，如水解、氧化降解及光降解等。

近期，四环素降解基因tet(X)新亚型的发现，为解决四环素的残留问题提供一些新思路。tet(X)可编码一种依赖于黄素的单加氧酶，该酶在O₂、NADPH、MgCl₂的参与下可以高效降解四环素类抗生素。

随着分子生物学的发展，通过基因工程的方法，以微生物为生物容器来合成功能蛋白具有广阔的前景。而在众多的表达宿主中，原核表达产量低，且有可能形成包涵体，不利于功能蛋白的分离纯化，且会增加分离纯化的成本。毕赤酵母是最近迅速发展的一种真核表达宿主，营养要求不高，适合于高密度发酵的大规模生产方式，其分泌自身的蛋白很少，有利于表达产物的分离和纯化。

因此，通过分子生物学手段和遗传工程技术，有望通过基因tet(X)和毕赤酵母构建一种可降解四环素类抗生素的工程酵母，从而为四环素类抗生素的降解提供了一种新的途径。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明的首要目的是提供一种编码四环素类抗生素降解酶的优化基因tet(X)^*。

本发明的第二个目的是提供一种能分泌四环素类抗生素降解酶Tet(X)的工程酵母。

本发明的第三个目的是提供一种能分泌四环素类抗生素降解酶Tet(X)的工程酵母的构建方法。

本发明的第四个目的是提供上述工程酵母在降解四环素类抗生素中的应用。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：

本发明提供一种编码四环素类抗生素降解酶的优化基因tet(X)^*，该基因由tet(X)基因优化而来，优化后的tet(X)^*适用于真核表达系统，该优化基因具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸优化序列。

Tet(X)是一种依赖于黄素的单加氧酶，该酶在O₂、NADPH、MgCl₂的参与下可以高效降解四环素类抗生素。本发明的编码四环素类抗生素降解酶的优化基因tet(X)^*是在tet(X)原序列(如SEQ ID NO：1所示)的基础上进行优化后得到的，优化后的tet(X)^*基因在真核表达体系中具有更高的表达水平。