[发明专利]一种红花檵木查尔酮异构酶LcCHI基因及其应用

说明书

从红花檵木中克隆获得查尔酮异构酶同源基因LcCHI。LcCHI基因的开放阅读框长度为657bp，编码218个氨基酸。红花檵木LcCHI与包括玫瑰、月季在内的多种植物CHI的氨基酸序列同源性很高。CHI负责酶催化活性的5个氨基酸残基位点也在不同植物的CHI氨基酸序列中高度保守。LcCHI蛋白的三级结构主要由8个α螺旋和11个β折叠片层形成的球状蛋白，其催化核心区域具有两个硝酸根配基结合位点。成功构建LcCHI的过表达载体，在拟南芥中异源表达并获得基因过表达的转基因株系，为该基因功能分析鉴定基础。红花檵木LcCHI基因的克隆和转基因研究可为红花檵木中类黄酮生物合成分子机制奠定基础。

技术领域

本发明所提供的查合酮异构酶基因是首次从红花檵木中克隆获得的。黄酮类物质是 一种重要的植物次生代谢产物。查尔酮异构酶基因是黄酮类物质生物合成途径中的第二个 限速酶类。该基因的成功克隆，为红花檵木的品种选育提供重要依据，也为黄酮类化合物 富集的转基因植物株系研究提供基础。

背景技术

本发明通过转录组测序的方法获得红花檵木查尔酮异构酶的cDNA序列，PCR扩增得到查尔酮异构酶的ORF全序列。利用本发明可以对红花檵木进行基因工程改造，利用转基因的方法对将LcCHI转化到红花檵木中，以红花檵木中包括花青苷在内的黄酮类物质含量的提高；或者利用该基因进行红花檵木品种筛选与鉴定，得到高黄酮含量的植物品种等，为红花檵木中特定的目的次生代谢产物富集的提供基础。在红花檵木中克隆到查尔酮异构酶基因，是研究红花檵木中黄酮类物质合成途径的基础，能够为红花檵木品种选育提供理论依据，也为黄酮类物质含量高的转基因株系研究提供基础。

发明内容

红花檵木(Loropetalum chinense var.rubrum)是我国特色的观花观叶植物，其花、 叶中均可合成花青苷物质而显红色。红花檵木的红色叶片具有较高的观赏价值，但我国南 方地区夏季持续高温会导致其叶片颜色由红变绿，观赏价值严重降低。目前，利用生理学 研究方法对红花檵木叶色变化的机制开展了一些研究，并获得了红花檵木叶片响应高温、 湿度和干旱条件下的叶色变化机制。然而，尚未有红花檵木中花青苷物质合成分子机制的 研究，花青苷合成途径基因的克隆目前只有LcCHS基因得到克隆。因此，开展红花檵木花 青苷形成的分子机制的研究，筛选花青苷合成酶相关基因及功能鉴定，对于红花檵木的叶 色育种有重要的意义。

在植物花青苷生物合成途径中，多个催化酶类参与了花青苷物质的合成。查尔酮异 构酶(chalcone isomerase，CHI)直接催化底物查尔酮形成二氢黄酮，是花青苷物质合成途 径的第二个限速酶类，也影响了其他5种黄酮类物质(包括黄酮醇类、黄烷酮类、黄酮类、异黄酮类、黄烷醇类)的积累。因此，克隆出红花檵木的LcCHI基因并对其功能进行 研究，为红花檵木花青苷生物合成途径的研究提供基础，能够为红花檵木花色育种提供重 要依据，也为黄酮类化合物富集的转基因植株研究提供物质。

2.1红花檵木查尔酮异构酶(以下均称为LcCHI)编码基因的克隆

1)红花檵木叶片RNA的提取及反转录第一链cDNA

以红花檵木叶片为材料，利用北京艾德莱生物科技有限公司的植物多糖多酚试剂盒，按照 其操作方法提取RNA，获得了红花檵木叶片的总RNA，并用1％琼脂糖凝胶电泳检测(附图1：红花檵木总RNA电泳图)，结果表明，红花檵木RNA的28S和18S条带清晰，质量 较好。

利用生工生物(上海)股份有限公司的M-MuLV逆转录酶合成第一链cDNA，反应 步骤如下：

试剂：总RNA 7μl，Oligo(dT)18 2μl，DEPC水1.5μl，总体积11.5μl 混匀后，65℃水浴锅孵育5min，放置于冰上冷却。

按指定顺序加入以下组分：