[发明专利]一种用于苹果病毒病检测的引物组、试剂盒和检测方法

权利要求书

1.一种用于苹果病毒病检测的引物组，所述引物组包括分别扩增苹果锈果类病毒、苹果花叶病毒、苹果褪绿叶斑病毒、苹果茎痘病毒和苹果茎沟病毒的引物对；所述扩增苹果褪绿叶斑病毒的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；所述扩增苹果茎沟病毒的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；所述扩增苹果茎痘病毒的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；所述扩增苹果花叶病毒的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；所述扩增苹果锈果类病毒的引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.9和SEQ ID NO.10。

2.一种用于苹果病毒病检测的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1所述引物组。

3.一种苹果病毒病的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：

1)提取脱毒试管苗总RNA，再反转录为cDNA；

2)利用权利要求1所述引物组对所述cDNA进行PCR扩增，得到扩增产物；

3)对扩增产物进行凝胶电泳，观察电泳条带；

若扩增产物中检测到大小为331bp的扩增片段，则苹果褪绿叶斑病毒检测结果为阳性，若扩增产物中未检测到大小为331bp的扩增片段，则苹果褪绿叶斑病毒检测结果为阴性；

若扩增产物中检测到大小为161bp的扩增片段，则苹果花叶病毒检测结果为阳性，若扩增产物中未检测到大小为161bp的扩增片段，则苹果花叶病毒检测结果为阴性；

若扩增产物中检测到大小为265bp的扩增片段，则苹果茎痘病毒检测结果为阳性，若扩增产物中未检测到大小为265bp的扩增片段，则苹果茎痘病毒检测结果为阴性；

若扩增产物中检测到大小为524bp的扩增片段，则苹果茎沟病毒检测结果为阳性，若扩增产物中未检测到大小为524bp的扩增片段，则苹果茎沟病毒检测结果为阴性；

若扩增产物中检测到大小为278bp的扩增片段，则苹果锈果病毒检测结果为阳性，若扩增产物中未检测到大小为278bp的扩增片段，则苹果锈果病毒检测结果为阴性。

4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增体系以25μL计包括：cDNA2μL，NTP1μL，10*PCR Buffer2.5μL，MgCl₂1.5μL，引物对中的每个引物各1μL，Taq DNA聚合酶0.3μL，用无菌双蒸水补足25μL；所述引物对选自分别扩增ASLSV、ASGV、ASPV、ApMV及ASSVd病毒的引物对中的一种。

5.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增程序为：

ACLSV的反应程序：94℃预变性5min；94℃1min、54℃30s、72℃2min，30个循环；72℃延伸10min；

ASGV的反应程序：94℃预变性5min；94℃1min、58℃30s、72℃2min，30个循环；72℃延伸10min；

ASPV的反应程序：94℃预变性5min；94℃1min、57℃30s、72℃2min，30个循环；72℃延伸10min；

AMV的反应程序：94℃预变性5min；94℃1min、53℃30s、72℃2min，30个循环；72℃延伸10min；

ASSVd的反应程序：94℃预变性5min；94℃1min、57℃30s、72℃2min，30个循环；72℃延伸10min。