[发明专利]一种用于苹果病毒病检测的引物组、试剂盒和检测方法

说明书

本发明公开了一种用于苹果病毒病检测的引物组、试剂盒和检测方法，涉及农业技术领域，所述检测方法：提取脱毒试管苗总RNA，再反转录为cDNA；分别利用扩增ASLSV、ASGV、ASPV、ApMV及ASSVd病毒的引物对对cDNA进行PCR扩增，得到扩增产物；对扩增产物进行凝胶电泳，观察电泳条带；扩增产物中检测到与病毒大小相应的扩增片段的为阳性；无相应扩增片段的为阴性。本发明采用RT‑PCR法检测苹果病毒，优化反应程序，确定各病毒适宜的退火温度，从而快速准确地检测样品是否携带病毒，检测的准确率和正确率100％，准确率和灵敏度高，可用于规模化的组培生产，为无病毒苗木的繁育提供技术支撑。

技术领域

本发明涉及农业技术领域，尤其涉及一种用于苹果病毒病检测的引物组、试剂盒和检测方法。

背景技术

苹果树是多年生植物，在自然界的长期繁殖过程中，感染并积累了多种病毒。目前世界上报道的苹果病毒病有39种，其中显性病毒有25种，潜隐性病毒14种。我国现已鉴定明确的苹果病毒病有6种，分别为苹果锈果类病毒(ASSV)、苹果花叶病毒(ApMv)、苹果绿皱果病毒(AGrCV)、苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)、苹果茎痘病毒(ASPV)和苹果茎沟病毒(ASGV)，其中前3种属显性病毒，后3种为潜隐性病毒。苹果生产上规定只要脱除这六种病毒就可认为是无病毒。

非潜隐性的苹果病毒病根据症状即可识别，而潜隐性病毒的鉴定需借助一定的技术和方法才能鉴定。针对苹果锈果病毒(ASSVd)、苹果花叶病毒(APMV)、苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)、苹果茎沟病毒(ASGV)和苹果茎痘病毒(ASPV)等几种苹果主要病毒，目前我国苹果潜隐性病毒的检测技术有血清学、木本指示植物法，酶联免疫吸附测定法(ELISA)、分子杂交技术、聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)等方法。

传统技术常采用木本植物指示法和酶联免疫吸附测定法(ELISA)进行病毒检测。木本指示植物法方法需时长而费工，酶联免疫吸附测定法检测技术具有较高灵敏度，但需要制备相应的抗血清，这就要求较高的设备条件和技术条件，加之苹果潜隐性病毒在苹果组织中的含量很低，而不少潜隐性病毒迄今尚未分离提纯成功。

发明内容

有鉴于此，本发明实施例提供了一种用于苹果病毒病检测的引物组、试剂盒和检测方法，主要目的是解决检测效率和灵敏度低问题。

为达到上述目的，本发明主要提供了如下技术方案：

本发明提供了一种用于苹果病毒病检测的引物组，所述引物组包括分别扩增苹果锈果类病毒、苹果花叶病毒、苹果褪绿叶斑病毒、苹果茎痘病毒和苹果茎沟病毒的引物对；所述扩增苹果褪绿叶斑病毒的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；所述扩增苹果茎沟病毒的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；所述扩增苹果茎痘病毒的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；所述扩增苹果花叶病毒的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；所述扩增苹果锈果类病毒的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10。

本发明提供了一种用于苹果病毒病检测的试剂盒，所述试剂盒包括上述方案所述引物组。

本发明提供了一种苹果病毒病的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：

1)提取脱毒试管苗总RNA，再反转录为cDNA；

2)利用权利要求1所述引物组对所述cDNA进行PCR扩增，得到扩增产物；

3)对扩增产物进行凝胶电泳，观察电泳条带；

若扩增产物中检测到大小为331bp的扩增片段，则苹果褪绿叶斑病毒检测结果为阳性，若扩增产物中未检测到大小为331bp的扩增片段，则苹果褪绿叶斑病毒检测结果为阴性；