[发明专利]一种对硫磷半抗原、完全抗原的制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种对硫磷半抗原、完全抗原的制备方法与应用，所述对硫磷抗原以1份3‑氯‑4‑羟基苯甲酸甲酯溶解在3‑4份乙腈中，加入2‑3份无水碳酸钾和1.2份氯硫代磷酸二乙酯制得中间体：3‑氯‑4‑((二乙氧基硫代硫代)氧基)苯甲酸甲酯，将中间体溶于3‑4份四氢呋喃，加入等体积的6mol/L盐酸，制得化合物：3‑氯‑4‑((二乙氧基硫代磷酰基)氧基)苯甲酸，即为对硫磷半抗原。将半抗原与载体蛋白偶联，制备得到完全抗原。免疫动物实验表明本发明制备的人工抗原具有良好免疫原性。本发明的抗原和抗原可用于对硫磷免疫分析检测，应用前景十分广阔。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种对硫磷半抗原、完全抗原的制备方法与应用。

背景技术

有机磷农药，因广谱和高效特点在我国曾被广泛使用，据相关统计，过去10年其产量几乎占我国市场份额的1/3。经研究发现，大量使用的有机磷类农药未能及时降解，且在特定条件下半衰期更长，并能通过食物链在生物体内蓄积，这对人、畜构成威胁，同时也给农产品、食品的销售及安全出口带来了影响。对硫磷是有机磷农药一种，由于其高毒性，可致癌致畸致突变，已被我国禁用且被列为重点监测对象。我国食品安全国家标准GB2763-2016《食品中农药最大残留限量》中规定蔬菜类对硫磷的最大残留限量为0.01mg/kg，谷物类的最大残留量为0.1mg/kg，水果类为0.01mg/kg。

目前色谱法用于对硫磷检测较广，包括气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、气质联用(GC-MS)、液质联用(LC-MS)、超临界流体色谱(SFC)、毛细管电泳(CE)，气相色谱-红外光谱联用(GC/FTLR)等方法，但这些方法需要昂贵的仪器、专业的操作人员，且样品前处理复杂、成本高、时间长，不能实现大量样品的快速检测，因此建立快速简便的对硫磷检测方法具有重要意义。

酶联免疫法(ELISA)是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。建立小分子的检测方法，其首要条件是进行半抗原和抗原的制备。优秀的半抗原、抗原可以激发被免疫动物产生灵敏度高、特异性好的抗体。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种对硫磷半抗原的制备方法。

本发明所提供的对硫磷半抗原，其化学名为：3-氯-4-((二乙氧基硫代磷酰基)氧基)苯甲酸，结构式如下：

上述对硫磷半抗原通过包括如下步骤的方法制备得到：

1)使得3-氯-4-羟基苯甲酸甲酯与硫代磷酸二乙酯发生酯化反应，得到中间体3-氯-4-((二乙氧基硫代硫代)氧基)苯甲酸甲酯；

2)使得中间体3-氯-4-((二乙氧基硫代硫代)氧基)苯甲酸甲酯在酸性条件下水解，得到3-氯-4-((二乙氧基硫代磷酰基)氧基)苯甲酸，即对硫磷半抗原。

上述方法步骤1)中，所述酯化反应可在无水碳酸钾存在下进行；

3-氯-4-羟基苯甲酸甲酯与无水碳酸钾的摩尔比可为：1：2-3；

3-氯-4-羟基苯甲酸甲酯与硫代磷酸二乙酯的摩尔比可为：1：1-1.5，具体可为1:1.2；

所述反应在加热回流条件下进行，所述反应的温度可为80℃，时间可为2～3小时；

所述反应在有机溶剂中进行，所述有机溶剂具体可为乙腈；

所述反应完成后，待反应体系冷却至室温，加入水淬灭反应，接着加入乙酸乙酯萃取分层，收集有机层干燥浓缩后柱色谱分离得到中间体3-氯-4-((二乙氧基硫代硫代)氧基)苯甲酸甲酯。

上述方法步骤2)中，所述水解在有机溶剂中进行，所述有机溶剂具体可为四氢呋喃；