[发明专利]牛微小隐孢子虫特异性引物及其PCR检测方法和应用

说明书

本发明涉及寄生虫检测技术领域，具体涉及一种牛微小隐孢子虫特异性引物及其PCR检测方法和应用。该方法能够快速、敏感、特异地检测出样品中的微小隐孢子虫。本发明牛微小隐孢子虫特异性引物序列为：上游引物CpF：5’‑AGTGGTTACAGGTGGGATGAGT‑3’；下游引物CpR：5’‑GCGAGTTTCCTTGATTCATAGC‑3’；该引物的普通PCR和纳米PCR检测方法：首先从待测样本中提取微小隐孢子虫的DNA，然后以DNA为模板，用特异性引物进行PCR扩增并对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现410 bp左右的特异性条带，则表明样本中存在牛微小隐孢子虫。

一、技术领域：

本发明涉及寄生虫检测技术领域，具体涉及一种牛微小隐孢子虫特异性引物及其PCR检测方法和应用。

二、背景技术：

牛的隐孢子虫病是由隐孢子虫(Cryptosporidium)寄生于牛胃肠道上皮细胞引起的一种危害严重的寄生虫病。研究发现，牛常见的隐孢子虫有4种，分别为微小隐孢子虫(C.parvum)、安氏隐孢子虫(C.andersoni)、牛隐孢子虫(C.bovis)和瑞氏隐孢子虫(C.ryanae)。其中，微小隐孢子虫是一种重要的人兽共患种类，严重威胁着人和家畜的健康。在我国，某些地区断奶前乳牛C.parvum感染率可高达31.4％，其感染会引起犊牛剧烈的水样腹泻，导致严重脱水甚至死亡。成年牛感染也会有短时间的体重下降，生产性能受损，给畜牧业生产造成严重的经济损失。更为重要的是，牛尤其是犊牛在动物和人的隐孢子虫病互传中扮演着主要角色，受C.parvum感染的牛可通过粪便散布病原，污染饲料、饮水，并可污染奶源，成为人的食源性和水源性隐孢子虫病爆发的重要原因之一。

目前，临床上对于牛的隐孢子虫病的诊断主要包括基于粪便中卵囊的饱和蔗糖漂浮法、改良抗酸染色法、荧光抗体染色法和巢式PCR法。基于形态学和显微镜观察的饱和蔗糖漂浮法和改良抗酸染色法虽然简单、方便，但其敏感性和特异性差，且需要专业人员，不适用于基层临床应用；荧光抗体染色法虽然较为敏感和特异，但其需要昂贵的荧光显微镜和抗体。巢式PCR技术以其高的特异性和敏感性广泛用于牛的隐孢子虫的检测。但是，该方法操作较为繁琐，需要进行两轮PCR扩增，耗时耗力，且需要借助测序技术才能进行种类鉴定。

近年来，普通PCR方法由于适用于大部分病原的检测，且检测结果较为准确，相应设备和试剂的价格比其他PCR方法低廉，在实验室病原检测方面得到了广泛应用。此外，随着纳米技术的逐渐兴起并广泛应用于分子生物学领域，纳米PCR应运而生。纳米PCR的原理是在普通PCR体系中加入纳米颗粒，利用纳米颗粒优良的导热性，缩短扩增过程中的升温和降温时间，使整个反应体系在最短时间内达到平衡温度从而提高扩增效率；更为重要的是，纳米颗粒能与单链DNA结合发挥类似单链结合蛋白SSB的作用，显著降低引物和模板的错配，提高PCR反应的特异性，有效减少非特异性扩增。2005年，中科院应用物理研究所与上海交通大学首次报道纳米金可以显著改善PCR非特异性扩增，且在较宽温度范围有效；而其他研究者的大量试验结果表明，纳米PCR的敏感性比普通PCR高出100～1000倍。

三、发明内容

本发明提供一种牛微小隐孢子虫特异性引物及其PCR检测方法和应用，其利用自行设计的特异性引物，通过优化反应条件，分别建立了牛微小隐孢子虫的普通PCR和纳米PCR检测方法，旨在为牛微小隐孢子虫病的临床诊断提供更加快速准确高效的病原检测方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种牛微小隐孢子虫特异性引物，其特征在于：所述的特异性引物序列如下：

上游引物CpF：5’-AGTGGTTACAGGTGGGATGAGT-3’；

下游引物CpR：5’-GCGAGTTTCCTTGATTCATAGC-3’。

特异性引物在检测牛微小隐孢子虫中的应用。

特异性引物在检测牛微小隐孢子虫的普通PCR检测方法：