[发明专利]重组人促红细胞生成素的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种重组人促红细胞生成素，其特征在于，所述的重组人促红细胞生成素是从柞蚕蛹或幼虫中表达制备获得。

2.一种重组人促红细胞生成素样品的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

（1）人工合成人促红细胞生成素基因：该基因编码成熟人促红细胞生成素蛋白的166个氨基酸，在基因5’端引入限制性内切酶BamH I识别序列GGATCC和蛋白起始密码子ATG，在基因3’端引入限制性内切酶EcoR I识别序列GAATTC和蛋白终止密码子TGA；hepo基因也可以用人组织cDNA为模板用PCR方法扩增获得；

（2）构建重组表达质粒：将柞蚕病毒转移表达载体pApM748BE和hepo基因分别用限制性内切酶BamH I和EcoR I 双酶切处理，琼脂糖凝胶电泳回收载体和基因片段，利用T4DNA连接酶连接载体和基因片段，并转化至大肠杆菌中；挑取单菌落进行培养，提取质粒DNA，并进行酶切鉴定，得到重组质粒pApM748BE/hepo；

（3）昆虫细胞准备：Tn-High Five 细胞用完全TNM-FH培养基进行传代培养至对数生长期，制成约0.5~1×10⁶/mL 细胞悬液，转至6孔细胞培养板中，使细胞密度占培养板的80%左右，27℃培养1~2小时，更换1~2mL无血清细胞培养基SF-900^TM II SFM，细胞可用于转染或重组病毒筛选；

（4）细胞转染：使用转染试剂Cellfectin，将pApM748BE /hepo重组质粒DNA和柞蚕ApNPV-Δph/egfp⁺病毒DNA共转染至Tn-High Five细胞，具体操作如下：将约0.5µg病毒DNA和约1µg重组质粒DNA加入到100µL的无血清细胞培养基SF-900^TM II中；将8µL的转染试剂Cellfectin加入到100µL的无血清细胞培养基SF-900^TM II中，再将DNA混合液与转染试剂混合液混匀，室温30~50分钟，将DNA与转染试剂的混合液转至预先准备好的细胞中，27℃培养4~5小时，更换完全TNM-FH培养基，27 ℃下继续培养4-5天；取细胞培养上清液，注射感染柞蚕蛹，约50~100μL/蛹，18-22℃孵育10-15天；

（5）重组病毒筛选：利用Tn-High Five 细胞，采用末端稀释法筛选重组病毒ApNPV-Δph/Δegfp/hepo⁺，将有hepo重组病毒和表达EGFP病毒混合感染的柞蚕蛹体液，用昆虫无血清细胞培养基SF-900^TM II SFM按照1：100的体积比稀释，过滤除菌，再将此无菌病毒液10倍梯度稀释，配制成10^-1、10^-2、10^-3和10^-4不同浓度病毒液；将梯度稀释的病毒液感染HighFive 细胞，用2%的低熔点琼脂糖固定，加入1-2mL的完全TNM-FH培养基，27℃培养4~5天；取出上层培养液，采用反向标记筛选的方法，用玻璃吸管将无EGFP标记的细胞挑出，分别悬浮在少量无血清细胞培养基中，振荡离心后取上清，注射感染柞蚕蛹，每头50~100uL，置18-22℃，10~15天；用显微镜观察或PCR检测方法分析筛选病毒的纯度；

（6）rhEPO 在柞蚕蛹中表达检测：将重组病毒ApNPV-Δph/Δegfp /hepo⁺注射接种至柞蚕蛹体内，置18-22℃孵育；分别取感染7、9、11、12、13、14及15天的柞蚕蛹体液进行蛋白质电泳，抗EPO抗体进行Western-blot检测，并进行定量分析；

（7）rhEPO柞蚕蛹冻干粉的制备：重组病毒ApNPV-Δph /Δegfp /hepo⁺批量感染柞蚕蛹；收集感染的柞蚕蛹，经匀浆，纱布过滤除去残渣，柞蚕蛹匀浆液冷冻干燥；收集冻干粉，分装保存于-80℃冰箱。

3.重组人促红细胞生成素在制备治疗小鼠脑型疟疾口服药物中的应用。