[发明专利]同时检测三种基因型的副溶血性弧菌的三重PCR引物、试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.同时检测三种基因型的副溶血性弧菌的三重PCR引物，其特征在于：各引物核苷酸序列如下：

TDH_F：5’-aggtctctgacttttggacaa-3’；

TDH_R：5’-atgttgaagctgtacttgat-3’

TRH_F：5’-tccttctcctgggtcggctga-3’

TRH_R：5’-tacacttggtattgattcttcg-3’

pVA1_F：5’-gaaggaagggcgaagccaat-3’

pVA1_R：5’-ttaacaatctgaatcaggaag-3’。

2.同时检测三种基因型的副溶血性弧菌的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的三重PCR引物、Taq酶、阳性对照DNA和阴性对照品。

3.根据权利要求2所述的同时检测三种基因型的副溶血性弧菌的试剂盒，其特征在于：所述各引物组分的浓度为0.4～0.5μmol/L；所述阳性对照DNA为副溶血性弧菌tdh基因、trh基因或pVA1质粒基因序列的DNA；所述阴性对照品为水。

4.根据权利要求2所述的同时检测三种基因型的副溶血性弧菌的试剂盒，其特征在于：所述阳性对照DNA为副溶血性弧菌tdh基因、trh基因或pVA1质粒基因的重组质粒。

5.一种利用权利要求1所述的同时检测三种基因型的副溶血性弧菌的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)提取待测样品基因组DNA模板；

(2)将提取获得的DNA模板、Taq酶和水混合进行三重PCR，三重PCR的扩增体系包括：10×扩增缓冲液5～8μl、四种dNTP混合物200～300μmol/L、引物0.4～0.5μmol/L、DNA模板2～5μg、Taq DNA聚合酶2～3U、MgCl₂1.5～2mmol/L，加双蒸水补足至50μl；

(3)采用琼脂糖凝胶电泳法对扩增后产物进行测定。

6.根据权利要求5所述的同时检测三种基因型的副溶血性弧菌的检测方法，其特征在于：四种dNTP混合物为三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸dATP、脱氧胸苷三磷酸dTTP、脱氧鸟苷三磷酸三钠dGTP和脱氧胞苷三磷酸dCTP，各组分的浓度分别为200μmol/L。

7.根据权利要求5所述的同时检测三种基因型的副溶血性弧菌的检测方法，其特征在于：所述扩增缓冲液包括100mM Tris-HCl(pH8.8，25℃)、500mM KCl、0.8％(v/v)乙基苯基聚乙二醇。

8.根据权利要求5所述的同时检测三种基因型的副溶血性弧菌的检测方法，其特征在于扩增程序为：90～95℃变性3～5min；(90～95℃15～20s、55～60℃30～35s、70～75℃40～45s)×30；70～75℃延伸4～8min。

9.根据权利要求5所述的同时检测三种基因型的副溶血性弧菌的检测方法，其特征在于：步骤(3)中，琼脂糖凝胶电泳测定的具体方法为：取扩增后的产物点样于琼脂糖凝胶，采用2000bp Marker为标准分子参照，以5V/cm的电场强度于0.5×TBE电泳缓冲液中电泳30min，电泳结果采用紫外凝胶成像系统分析、拍照。