[发明专利]同时检测三种基因型的副溶血性弧菌的三重PCR引物、试剂盒及其检测方法

说明书

本发明公开了同时检测三种基因型的副溶血性弧菌的三重PCR引物和试剂盒，其中三重PCR引物包括引物TDH_F、引物TDH_R、引物TRH_F、引物TRH_R、引物pVA1_F、引物pVA1_R，使用该引物制得的试剂盒，可用于检测副溶血性弧菌中是否含有tdh基因、trh基因或者pVA1质粒，特异性强，准确度高。

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及同时检测三种基因型的副溶血性弧菌的三重PCR引物、试剂盒及其检测方法。

背景技术

副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)，为革兰氏阴性杆菌，呈弧状、杆状、丝状等多种形状，无芽胞。目前，用于检测该菌的PCR方法主要有任意引物PCR(arbitrarilyprimedPCR，Ap-PCR)、常规PCR、多重PCR(multiplex-PCR)、实时PCR(Real-timePCR)。细菌鉴定的分子生物学方法通常采用检测细菌的16S rRNA基因，但是在亲缘关系较近的物种之间，16SrRNA基因差异较小，常常导致种间鉴定失败。KWOK等人对15种共29株海洋弧菌部分热休克蛋白HSP60基因序列分析表明，弧菌种间HSP60基因序列相似性为71％～82％，种内菌株间的相似行为96％～100％，与种间相似度很高的16S rRNA基因序列和常规鉴定系统相比，HSP60基因更适合于海洋弧菌的系统发育分析和鉴定。

不耐热溶血毒素tlh基因是Hatsumi等人在1985年发现，无论是临床分离株还是环境分离株都有tlh基因，具有种特异性，因此它的编码基因tlh基因常被用作检测副溶血性弧菌的靶基因。然而不是所有的副溶血性弧菌都有相同的致病性，耐热直接溶血毒素TDH和耐热直接溶血相关毒素TRH是引起腹泻的主要致病因子，所有的副溶血性弧菌都扩增出tlh基因，54％的副溶血性弧菌扩增出TDH基因，只有38.73％的副溶血性弧菌扩增出TRH基因。从2009年开始，一种特异性的副溶血性弧菌引起关注，该种菌株因携带了一种130kb大小的毒力质粒pVA1而具有特殊的毒性，其可以引起对虾肝胰腺上皮细胞大量脱落等。携带毒力质粒pVA1的副溶血性弧菌给对虾养殖业造成严重危害，但不会引起腹泻。因此根据不同的检测目的，需要选择不同的靶基因进行检测。

目前，基于副溶血性弧菌tlh基因、tdh基因、trh基因等的分子生物学方法建立的比较成熟，但是，由于pVA1是近几年研究确认的一种带有特殊毒性的质粒，所以目前国际上尚无能够同时检测副溶血性弧菌菌株是否含有tdh基因、trh基因，或者pVA1质粒的检测方法。因此，建立同时检测副溶血性弧菌菌株是否含有tdh基因、trh基因或者pVA1质粒的方法，能够极大的提高副溶血性弧菌菌株毒性的检测效率。

发明内容

为解决以上技术问题，本发明提出同时检测三种基因型的副溶血性弧菌的三重PCR引物、试剂盒及其检测方法，采用三重PCR引物、试剂盒以及检测方法对副溶血性弧菌进行检测，易于操作、特异性强、灵敏高、结果准确可靠。

本发明所提供的技术方案如下：

同时检测三种基因型的副溶血性弧菌的三重PCR引物，各引物核苷酸序列如下：

TDH_F：5’-aggtctctgacttttggacaa-3’；

TDH_R：5’-atgttgaagctgtacttgat-3’

TRH_F：5’-tccttctcctgggtcggctga-3’

TRH_R：5’-tacacttggtattgattcttcg-3’

pVA1_F：5’-gaaggaagggcgaagccaat-3’

pVA1_R：5’-ttaacaatctgaatcaggaag-3’。

本发明还公开了同时检测三种基因型的副溶血性弧菌的试剂盒，包括上述引物组合、Taq酶、阳性对照DNA和阴性对照品。