[发明专利]一种年老小鼠颏舌肌来源的成肌细胞的体外培养方法

权利要求书

1.一种年老小鼠颏舌肌来源的成肌细胞的体外培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）剪取年老的小鼠颏舌肌，置于无菌PBS缓冲液中进行清洗，去除颏舌肌中的脂肪组织及血液，随后放置于含有I型胶原酶的培养皿中，剪碎所述的颏舌肌组织，得到颏舌肌组织碎片和I型胶原酶的混合液；所述小鼠颏舌肌为12-16个月龄的老年C57BL/6小鼠颏舌肌；所述PBS缓冲液中含体积浓度为1%的PS，且使用前先于4℃条件下预冷；所述I型胶原酶的质量分数为0.05%-0.1%；

（2）收集所述步骤（1）得到的混合液置于离心管中，轻轻吹打混合均匀得到颏舌肌悬液，进行第一次消化，第一次消化期间每隔一段时间用吸管吹打使颏舌肌组织分散，离心去上清，吸去I型胶原酶后加入胰蛋白酶进行第二次消化，第二次消化期间每隔一段时间用吸管吹打使颏舌肌组织分散，终止消化；所述胰蛋白酶的质量分数为0.05%-0.25%，采用体积浓度为20%的FBS终止消化；

（3）将所述步骤（2）终止消化后得到的颏舌肌悬液进行离心，去上清液，得到的颏舌肌碎片用原代培养基进行重悬，轻轻吹打再混匀制成悬液，然后置于培养箱中采用差速贴壁培养法和半换液的方式进行培养，即得到所述的年老小鼠颏舌肌来源的成肌细胞；

所述原代培养基为含体积浓度为20%的FBS、体积浓度为1%的PS和体积浓度为0.6%的GlutaMAX的高糖型DMEM培养基；

采用差速贴壁培养法和半换液的方式进行培养的具体操作包括如下步骤：将所述悬液均匀转移至6孔板中，摇匀后置于37℃、5% CO₂的培养箱中贴壁培养0.5h后，吸取上清液转移至6孔板的另一孔中继续贴壁培养，每隔0.5h转移一次，共转移3-4次，3天后换传代培养基，以后每隔2天半换一次传代培养基，直到小鼠颏舌肌的成肌细胞增殖达到融合；所述传代培养基为含体积浓度为10%的FBS、体积浓度为1%的PS和体积浓度为0.6%的GlutaMAX的高糖型DMEM培养基。

2.根据权利要求1所述的体外培养方法，其特征在于，所述小鼠颏舌肌由以下方法得到：用眼科剪剪开小鼠颏下皮肤，暴露二腹肌，用弯镊分离二腹肌，用眼科剪剔除二腹肌后，暴露颏舌肌，用弯镍分离出颏舌肌后，用眼科剪将其近远心端离断，即得到所述小鼠颏舌肌。

3.根据权利要求1所述的体外培养方法，其特征在于，所述步骤（1）中，将所述颏舌肌组织剪碎成0.5-1cm³大小的颏舌肌组织碎片。

4.根据权利要求1所述的体外培养方法，其特征在于，所述步骤（2）中，所述第一次消化的温度为37℃，消化时间为30-40min，每隔10min用吸管吹打使组织分散，离心转速为1000r/min，离心时间为10min。

5.根据权利要求1所述的体外培养方法，其特征在于，所述步骤（2）中，所述第二次消化的温度为37℃，消化时间为30-40min，每隔10min用吸管吹打使组织分散。

6.根据权利要求1所述的体外培养方法，其特征在于，所述步骤（3）中，离心的转速为1000rpm，离心时间为10min。