[发明专利]一种年老小鼠颏舌肌来源的成肌细胞的体外培养方法

说明书

本发明公开了一种年老小鼠颏舌肌来源的成肌细胞的体外培养方法，包括如下步骤：将年老小鼠颏舌肌置于含有I型胶原酶的培养皿中，剪碎，得到颏舌肌组织碎片和I型胶原酶的混合液置于离心管中，轻轻吹打得到颏舌肌悬液，进行第一次消化，离心去上清，吸去I型胶原酶后加入胰蛋白酶进行第二次消化，终止消化后得到的颏舌肌悬液进行离心，去上清液，得到的颏舌肌碎片用原代培养基进行重悬，轻轻吹打再混匀制成悬液，然后置于培养箱中采用差速贴壁培养法和半换液的方式进行培养。本发明的体外培养方法，能够获得高纯度、高活率、高活性同时污染风险极低的颏舌肌成肌细胞，培养的细胞分化好、细胞活力高，培养周期短，培养效率高，具有较大的推广意义。

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，尤其涉及一种老年C57BL/6小鼠颏舌肌来源的干细胞原代分离培养方法。

背景技术

阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(OSA)是一种睡眠时易发生低通气的病理性疾病，随着年龄的增加，OSA的发病率不断增加。颏舌肌是上气道扩张肌中牵拉舌体向前运动的主要肌肉，称为“上气道安全肌”，对于气道开放和大小起决定性的作用，是研究OSA发病机制和寻求治疗途径的关键，其功能异常往往与OSA发病密切相关。成肌细胞对于肌肉生长和损伤具有重要作用，当肌纤维受到损伤或刺激时，成肌细胞开始增殖、分化并融合形成新的纤维，修复受损的肌组织。

年老颏舌肌来源的成肌细胞培养模型可以排除在体实验多种干扰因素的影响，在特定环境下研究特定因素对颏舌肌成肌细胞的作用。现有技术中已有一些颏舌肌成肌细胞的培养方法，但这些方法存在两个弊端：其一，颏舌肌通常来源年轻小鼠颏舌肌组织，无法模拟老年状态；其二，现阶段大家常采用的小鼠颏舌肌成肌细胞直接进行原代分离，所以分离出来的细胞纯度相对较低，同时活力也相对较差。利用体外培养的年老颏舌肌来源的成肌细胞建立多种病理生理模型，有利于从细胞和分子生物学水平研究老年OSA疾病的发明机制和预防手段，因此需要找到一种高效、稳定，分离出的细胞活性高、产量大、存活率高的年老小鼠颏舌肌成肌细胞的培养方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种高效、稳定，分离出的细胞活性高、产量大、存活率高的年老小鼠颏舌肌来源的成肌细胞的体外培养方法。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：

一种年老小鼠颏舌肌来源的成肌细胞的体外培养方法，包括如下步骤：

(1)剪取年老的小鼠颏舌肌，置于无菌PBS缓冲液中进行清洗，去除颏舌肌中的脂肪组织及血液，随后放置于含有I型胶原酶的培养皿中，剪碎所述的颏舌肌组织，得到颏舌肌组织碎片和I型胶原酶的混合液；

(2)收集所述步骤(1)得到的混合液置于离心管中，轻轻吹打混合均匀得到颏舌肌悬液，进行第一次消化，第一次消化期间每隔一段时间用吸管吹打使颏舌肌组织分散，离心去上清，吸去I型胶原酶后加入胰蛋白酶进行第二次消化，第二次消化期间每隔一段时间用吸管吹打使颏舌肌组织分散，终止消化；先后使用I型胶原酶和胰酶对组织进行消化，不但避免了对组织过度消化过度吹打所导致的细胞活性低、得率差的问题，而且消化得更均匀透彻；

(3)将所述步骤(2)终止消化后得到的颏舌肌悬液进行离心，去上清液，得到的颏舌肌碎片用原代培养基进行重悬，轻轻吹打再混匀制成悬液，然后置于培养箱中采用差速贴壁培养法和半换液的方式进行培养，即得到所述的年老小鼠颏舌肌来源的成肌细胞。

上述的体外培养方法，优选的，所述小鼠颏舌肌为12-16个月龄的老年C57BL/6小鼠颏舌肌；所述小鼠颏舌肌由以下方法得到：用眼科剪剪开小鼠颏下皮肤，暴露二腹肌，用弯镊分离二腹肌，用眼科剪剔除二腹肌后，暴露颏舌肌，用弯镍分离出颏舌肌后，用眼科剪将其近远心端离断，即得到所述小鼠颏舌肌。

优选的，所述步骤(1)中，所述PBS缓冲液中含体积浓度为1％的PS，且使用前先于4℃条件下预冷；将所述颏舌肌组织剪碎成0.5-1cm³大小的颏舌肌组织碎片。