[发明专利]一种伪狂犬病毒弱毒株及应用

说明书

本发明提供了一种伪狂犬病毒弱毒株，同时提供了该弱毒株的重组病毒的构建方法，以及将该弱毒株应用于疫苗制备。本发明采用伪狂犬病病毒中国流行株，经基因工程技术，将伪狂犬病病毒的毒力基因缺失，获得了TK、gE、11K联合缺失的重组病毒，该基因缺失重组病毒的疫苗具有安全性高、免疫保护效果好等优势。

技术领域

本发明属于兽用生物制品领域，具体涉及一种伪狂犬病毒弱毒株及应用。

背景技术

伪狂犬病(pseudorabies,PR)，是伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PR)引起的猪、牛、羊等多种家畜和野生动物以发热、奇痒及脑脊髓炎为主要症状的一种急性传染病。该病毒可以感染不同年龄段的猪，主要引起妊娠母猪流产、产死胎和木乃伊胎，哺乳仔猪出现神经症状，衰竭死亡，死亡率高达100％，给养猪业带来巨大损失。

现有伪狂犬病毒的免疫主要以Bartha-K61株制备的疫苗为主，但随着毒株的变异，该疫苗对变异后毒株不能提供有效的保护，亟需开发针对变异株的伪狂犬病毒疫苗。此外，在现有疫苗产品中基因缺失疫苗在减少伪狂犬病感染的机会，减轻感染后的症状，减少散毒量等方面都有较大的优势，因此成为当前预防控制该病的主要手段。但基因缺失疫苗也存在诸多缺陷，如人工缺失某些基因，一方面虽然使其毒力减弱，另一方面也会降低免疫原性，同时还会存在毒力返强的安全隐患。

发明内容

本发明提供了一种伪狂犬病毒弱毒株疫苗，解决了现有伪狂犬病毒疫苗不能对伪狂犬病毒的变异株起到有效保护的问题。

本发明提供了一种基因缺失的伪狂犬病毒及其构建方法，解决了现有基因缺失的伪狂犬病毒免疫原性低，在多次传代后毒力返强的问题。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种伪狂犬病毒弱毒株，所述弱毒株是同时缺失了部分TK氨基酸序列、部分GE氨基酸序列、部分11K氨基酸序列以及gE基因第56位碱基至11K基因的103位碱基间的基因序列。

进一步的，所述弱毒株缺失部分的氨基酸序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:3所示，所述基因序列如SEQ ID NO:4所示。

一种伪狂犬病毒弱毒株制备的伪狂犬病毒疫苗。

进一步的，该弱毒株的重组伪狂犬病毒的制备方法包括以下步骤：

(1)将pHA2质粒重组到猪伪狂犬病毒的TK基因内，获得rPRV；

(2)将rPRV基因组转化至大肠杆菌DH10B菌株，扩增获得pPRV；

(3)然后将pPRV转化至大肠杆菌GS1783中；

(4)通过Red/ET两步重组法在GS1783中缺失掉gE、11K基因；

(5)在步骤(4)获得的产物中提取质粒pPRV-dTK-dgE-d11K；

(6)将步骤(5)提取的质粒用脂质体转染法，转染至BHK-21细胞；

(7)提取感染性克隆质粒与转移载体共转染BHK-21细胞，通过同源重组将BAC质粒去掉，得到缺失TK、gE、11K中部分基因的重组伪狂犬病毒。

进一步的，构建该重组伪狂犬病毒弱毒株的载体包括：伪狂犬病毒TK基因和11K基因的部分序列。

进一步的，该载体还包括：CMV启动子控制下的EGFP基因。

进一步的，该疫苗的免疫方式包括滴鼻和注射。

相对于现有技术，本发明具有以下优势：

1、本发明提供的伪狂犬病弱毒株疫苗安全性高、免疫保护效果好，尤其对伪狂犬病变异株能起到有效的保护作用。