[发明专利]一种基于3D DNA纳米网状结构双信号放大技术的microRNA检测方法

权利要求书

1.一种基于3D DNA纳米网状结构双信号放大技术的电化学生物传感器的构建方法，其特征在于，包括步骤：

（A）靶标辅助的催化发卡自组装：先将发卡DNA探针H1固定在金电极表面，然后将发卡DNA探针H2与不同浓度的靶标混合后滴加至金电极表面，孵育，靶标打开H1的发卡结构，使其暴露出与H2杂交的区域，进而打开H2发卡结构形成稳定的H1-H2杂交双链体并产生游离尾部，同时释放出靶标；经过多次循环，产生大量带游离尾部的H1-H2杂交双链体，进入步骤（B）；

（B）3D DNA纳米网结构的自组装：多个X-DNA通过T4连接酶形成3D DNA网状结构，所述的X-DNA是由三条ssDNA杂交退火形成，步骤（A）产生的大量游离尾部组成X-DNA的第四条边，实现H1-H2杂交双链体与DNA网状结构的特异性杂交，完成金电极的修饰，进而构建得到电化学生物传感器；

其中，H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

将修饰的金电极作为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂电极作为对电极，组成三电极体系，即得所述的电化学传感器；

步骤（A）中，H1和H2提前经过95℃ 5分钟再缓慢降到25℃的退火过程制备；

步骤（A）的具体方法是：先将H1溶解于固定缓冲液中，随后滴加到金电极表面，置于37℃水浴箱过夜，使得H1固定在金电极表面；然后将H2与不同浓度靶标溶解于杂交缓冲液中，滴加至金电极表面，37℃孵育1.5小时；

步骤（B）中，所述X-DNA的制备方法如下：先将三条ssDNA与T4 Buffer、DEPC处理水混合后，于95℃加热2分钟，然后降温至65℃处理5分钟，接着降温至60℃处理3分钟，最后缓慢降温至25℃处理1小时，即得所述的X-DNA；

步骤（B）中，所述3D DNA纳米网结构的制备方法如下：向X-DNA中加入T4连接酶，16℃孵育30分钟，即得所述的3D DNA纳米网结构；

步骤（B）中，所述的三条ssDNA分别为X1-P、X2-P、X3-P，它们的核苷酸序列分别如SEQID NO.4～6所示。

2.利用权利要求1所述构建方法得到的一种基于3D DNA纳米网状结构双信号放大技术的电化学生物传感器。

3.权利要求2所述电化学生物传感器在非诊断目的的microRNA检测中的应用。