[发明专利]一种基于3D DNA纳米网状结构双信号放大技术的microRNA检测方法

说明书

本发明涉及一种基于3D DNA纳米网状结构双信号放大技术的microRNA检测方法，本发明基于靶标自循环的催化发卡自组装与3D DNA纳米网结构的整合，构建了一个双信号放大技术的电化学生物传感器。设计的两个发卡序列一旦被靶标启动，即可形成热力学稳定的杂交双链体结构，同时释放靶标进入下一个循环。该过程成功将靶标转换为更加稳定的结构，从而达到第一次信号放大的目的。随后引入了一个3D DNA纳米网结构，该结构由三条DNA序列杂交形成的X型DNA结构通过T4连接酶连接而成。3D DNA纳米网结构可与上述反应形成的双链体结构杂交，从而实现第二次信号放大。具有检测灵敏度高、检测特异性好等优点。

技术领域

本发明属于microRNA检测技术领域，涉及一种基于3D DNA纳米网状结构双信号放大技术的microRNA检测方法。

背景技术

循环microRNA(miRNA)是一类从活细胞分泌到细胞外环境中的小的非编码RNA，并且在各种体液(例如血液、尿液、胆汁、脑脊液和胰液)中保持相对稳定。由于其具有组织特异性来源、丰富的信息含量和易于收集的优势，循环miRNA已被证明可作为多种疾病临床诊断的理想非侵入性生物标记物。

目前，荧光法、微流控设备、电化学发光分析、比色法和电化学检测等多种新兴的生物传感技术已被用于miRNA的检测。在这些方法中，由于电化学生物传感器灵敏度高，样品需求量少，易于操作且成本低廉，被认为是检测循环miRNA的有前景的策略。

由于循环miRNA在细胞外环境的低丰度，因此需要更加有效的信号放大策略用于传感器的构建。目前，电化学传感器主要通过电极表面材料的改变进行信号放大，需要电极表面复杂的材料改变。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于3D DNA纳米网状结构双信号放大技术的microRNA检测方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、一种基于3D DNA纳米网状结构双信号放大技术的电化学生物传感器的构建方法，包括步骤：

(A)靶标辅助的催化发卡自组装(CHA)：先将发卡DNA探针H1固定在金电极表面，然后将发卡DNA探针H2与不同浓度的靶标混合后滴加至金电极表面，孵育，靶标打开H1的发卡结构，使其暴露出与H2杂交的区域，进而打开H2发卡结构形成稳定的H1-H2杂交双链体并产生游离尾部，同时释放出靶标；经过多次循环，产生大量带游离尾部的H1-H2杂交双链体，进入步骤(B)；

(B)3D DNA纳米网结构的自组装：多个X-DNA通过T4连接酶形成3D DNA网状结构，所述的X-DNA是由三条ssDNA(单链DNA)杂交退火形成，步骤(A)产生的大量游离尾部组成X-DNA的第四条边，实现H1-H2杂交双链体与DNA网状结构的特异性杂交，完成金电极的修饰，进而构建得到电化学生物传感器；

其中，H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的，将修饰的金电极作为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂电极作为对电极，组成三电极体系，即得所述的电化学传感器。

优选的，步骤(A)中，所述靶标为miR-21，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

优选的，步骤(A)中，H1和H2提前经过95℃5分钟再缓慢降到25℃的退火过程制备。

优选的，步骤(A)的具体方法是：先将H1溶解于固定缓冲液中，随后滴加到金电极表面，置于37℃水浴箱过夜(12小时)，使得H1固定在金电极表面；然后将H2与不同浓度靶标溶解于杂交缓冲液中，滴加至金电极表面，37℃孵育1.5小时。