[发明专利]一种羊膜间充质干细胞的培养及冻存方法

权利要求书

1.一种羊膜间充质干细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）羊膜组织分离：取胎盘组织，经浸泡、洗涤后，分离得到羊膜组织；

（2）羊膜间充质干细胞分离：向羊膜组织中加入混合酶消化液进行消化，过滤收集滤液，将滤液离心后弃上清，得到沉淀物；所述羊膜组织与混合酶消化液之间的体积比为1:0.8-1.2，所述消化为在37℃条件下消化90-120min；

（3）P0代羊膜间充质干细胞培养：向步骤（2）所述沉淀物中加入无血清培养基进行重悬，得到细胞悬液，经接种、无血清培养基培养后，加入胰蛋白酶消化，然后离心，弃上清，所得沉淀物即为P0代羊膜间充质干细胞；所述无血清培养基的组成为：90%a-MEM +5%血小板裂解液+10ng/ml表皮细胞生长因子+10ng/ml重组碱性成纤维细胞生长因子+2mmol/L L-谷氨酰胺；

（4）扩增培养：将步骤（3）所述P0代羊膜间充质干细胞分种至新的无血清培养基中进行传代培养，传至P3代时进行收获，得到纯化的羊膜间充质干细胞；

所述混合酶消化液按如下方法制备：将中性蛋白酶、脱氧核糖核酸酶I以及胶原酶IV溶于DME/F12中，即得；所述混合酶消化液中各组分的终浓度为：1.5-2U/mL中性蛋白酶、0.5mg/mL脱氧核糖核酸酶I、1mg/mL胶原酶IV。

2.根据权利要求1所述的羊膜间充质干细胞的培养方法，其特征在于，步骤（1）中，先用PBS缓冲液浸泡2-3min，再用75%酒精浸泡1-2min，然后用生理盐水进行所述洗涤。

3.根据权利要求1所述的羊膜间充质干细胞的培养方法，其特征在于，步骤（2）中，所述过滤为采用150-250目过滤网过滤，所述离心的转速为1500-2000rpm，所述离心的时间为6-10min。

4.根据权利要求1所述的羊膜间充质干细胞的培养方法，其特征在于，步骤（3）中，所述接种密度为1-3×10⁴个/cm²，所述培养为在37±0.5℃，75±5%RH，5±0.5%CO₂的培养箱中进行培养，进行所述培养至细胞生长达到80-90%融合；所述消化为在37℃条件下消化2-3min，进行所述消化至细胞呈圆球状；所述离心的转速为1000-1500rpm，所述离心的时间为4-6min。

5.根据权利要求1所述的羊膜间充质干细胞的培养方法，其特征在于，步骤（4）中，所述分种率为1:3-1:6，所述传代培养为在37±0.5℃，75±5%RH，5±0.5%CO₂的培养箱中进行培养。