[发明专利]一种羊膜间充质干细胞的培养及冻存方法

说明书

本发明涉及一种羊膜间充质干细胞的培养及冻存方法，所述培养方法包括羊膜组织分离、羊膜间充质干细胞分离、P0代羊膜间充质干细胞培养以及扩增培养。本发明所述羊膜间充质干细胞的培养方法，在羊膜间充质干细胞分离阶段，通过采用特殊的混合酶消化液体系(消化液中各组分终浓度：1.5‑2U/mL中性蛋白酶、0.5mg/mL脱氧核糖核酸酶I以及1mg/mL胶原酶IV)进行消化，能够更为有效的从羊膜组织中分离羊膜间充质干细胞，进而显著提高P0代细胞得率，本发明采用一步消化法，相对传统的两步消化，操作更便捷，培养得到的羊膜间充质干细胞活性好，得率高、纯度高，重复性好。

技术领域

本发明属于干细胞培养技术领域，具体涉及一种羊膜间充质干细胞的培养及冻存方法。

背景技术

近年来随着对间充质干细胞功能特性的深入研究，间充质干细胞已经成为细胞替代治疗的研究热点。而人羊膜间充质干细胞除与应用广的骨髓间充质干细胞样具有多向分化潜能、免疫调节、造血支持等特性外，还具有来源广泛，取材方便，无伦理限制，细胞增殖能力强等优势。在各种组织器官中存活率高，存活时间长。源自胎盘羊膜组织的羊膜间充质干细胞是具有明显可塑性和多向分化潜能的一种成体干细胞，在不同生长因子的调节下，可分化成来源于2个胚层的不同组织细胞类型，如脂肪细胞、成骨细胞、肝样细胞、心肌样细胞、神经胶质细胞等，HAMSC不表达主要组织相容性II类抗原，微量表达主要组织相容性I类抗原，免疫原性低，移植排斥作用小，而且具有免疫调节功效，在干细胞治疗、组织工程治疗和再生医学研究应用中具有重要意义。

现有羊膜间充质干细胞提取方法，将羊膜从绒毛膜上分离，用不同浓度的胰酶，中性蛋白酶或其他消化酶进行不同时间的消化将hAEC从基底膜上消化下来，然后用胶原酶对多为hAMSC进行消化分离，过程较为复杂，操作时间长，且得率不高。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种羊膜间充质干细胞的培养及冻存方法。所述培养方法在羊膜间充质干细胞分离阶段，通过采用特殊的混合酶消化液体系进行消化，能够更为有效的从羊膜组织中分离羊膜间充质干细胞，进而显著提高P0代细胞得率，本发明采用一步消化法，相对传统的两步消化，操作更便捷，培养得到的羊膜间充质干细胞活性好，得率高、纯度高，重复性好。

本发明的技术方案为：

一种羊膜间充质干细胞的培养方法，包括如下步骤：

(1)羊膜组织分离：取胎盘组织，经浸泡、洗涤后，分离得到羊膜组织；

(2)羊膜间充质干细胞分离：向羊膜组织中加入混合酶消化液进行消化，过滤收集滤液，将滤液离心后弃上清，得到沉淀物；

(3)P0代羊膜间充质干细胞培养：向步骤(2)所述沉淀物中加入无血清培养基进行重悬，得到细胞悬液，经接种、培养后，加入胰蛋白酶消化，根据上皮细胞和间质细胞对胰蛋白酶的耐受性不同,在消化细胞时,常是间质细胞先脱壁,而上皮细胞要消化相当长时间才脱壁。细胞消化2-3min时，间充质干细胞即可消化下来,收集消化下来的细胞离心，弃上清，所得沉淀物即为P0代羊膜间充质干细胞；

(4)扩增培养：将步骤(3)所述P0代羊膜间充质干细胞分种至新的无血清培养基中进行传代培养，通过2至3次传代，传至P3代时进行收获，得到纯化的羊膜间充质干细胞；

所述混合酶消化液按如下方法制备：将中性蛋白酶、脱氧核糖核酸酶I以及胶原酶IV溶于DME/F12中，即得；所述混合酶消化液中各组分的终浓度为：1.5-2U/mL中性蛋白酶、0.5mg/mL脱氧核糖核酸酶I、1mg/mL胶原酶IV。

优选的，步骤(1)中，先用PBS缓冲液浸泡2-3min，再用75％酒精浸泡1-2min，然后用生理盐水进行所述洗涤。