[发明专利]鉴别皱果苋与2种常见混淆品的分子特异性标记引物及方法

说明书

本发明公开了鉴别皱果苋与2种常见混淆品的分子特异性标记引物及方法，属于生物技术领域。依据皱果苋、白苋、反枝苋的matK基因序列，设计上游特异性正向引物：AvF：5’‑CTTTTTGTTCCTATATAATCTAG‑3’、AaF：5’‑CTAGTAAAAGTCAAAGTTAAGCG‑3’、ArF：5’‑GACTCAATTCTTCAGTAATACCA‑3’和下游通用反向引物matk‑R：5’‑TATAATAATGAGAAAGATTTCGG‑3’。利用特异性引物分别构建多重PCR体系和荧光定量PCR反应体系，实现对皱果苋、白苋、反枝苋相互之间的快速、准确的定性和定量鉴别。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及鉴别皱果苋与2种常见混淆品的分子特异性标记引物及方法。

背景技术

药用植物皱果苋（Amaranthus viridis L.）全草可入药，有清热解毒、利尿止痛的功效。皱果苋由于含有丰富的蛋白质、核黄素、镁、脂肪、维生素C、膳食纤维等营养成分，在民间也常被作为野菜应用。其野生植物种质资源分布广，目前尚未形成栽培品种。由于白苋（Amaranthus albus L.）、反枝苋（Amaranthus retroflexus L. ）与皱果苋形态相似，且具有类似的分布地，常伴生，很容易相混淆与误用。白苋、反枝苋是皱果苋常见的混淆品，但是他们有不同的属性和药用价值，其中反枝苋主要用于治腹泻、痢疾、痔疮肿痛出血等症。白苋具有清热解毒的功效，外敷可以治疮肿，牙疳，虫咬。特别白苋的别称较多，在民间也常被别称为“皱果苋”，容易导致相互混用。因此，急需对三者进行准确鉴别，以确保准确用药。

虽然皱果苋新鲜叶片通过静脉、附属物和叶的非腺毛维管束结构之间的显微鉴定差异从其混淆品中鉴别出来，但是粉末或粉碎片形式的皱果苋与2种常见植物通过形态学和组织学技术是很难识别的。在过去的几年中，利用化学分析技术如TLC、HPLC 、MS等方法进行识别中药材。虽然这些方法在某种程度上可以补充形态学或组织学鉴定的局限性，但化学指纹图谱只能检测部分化合物，只能提供有限的物种组成信息，不能简便的进行准确鉴别，特别是在和它极为相似的物种鉴别中。因此，选择恰当的鉴别皱果苋产品的方法对监测质量至关重要。

随着分子生物学的发展，DNA分子标记如RAPD、ISSR和SSR等分子标记， ITS（Internal transcribed spacer）等DNA条形码技术提供了可靠的识别药材的方法。然而，这些基于基因组DNA的分子标记技术容易受到基因组DNA降解的影响，由于核基因组DNA比叶绿体DNA拷贝数少，在加工过的药材中更容易遭破坏而导致无法通过其分子标记技术进行鉴别。叶绿体matK基因序列作为DNA条形码，它可以很容易利用通用引物进行扩增，这一序列已被证明可用于对多种植物在种水平的识别，被广泛用于植物产品的检测。本课题组在前期研究中也发现，对于干燥或经加工过的药材，基于叶绿体DNA matK基因序列的鉴别技术比基于核基因组DNA的分子标记技术更为稳定有效。

本研究对皱果苋、白苋、反枝苋的matK基因序列进行测序，分析其序列结构和特征，寻找单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphism SNP)分子标记，设计分别识别皱果苋、白苋、反枝苋的特异识别引物，建立多重PCR技术与荧光定量PCR，可快速简单鉴别皱果苋、白苋与反枝苋的方法。本发明为皱果苋与2种常见混淆品的分子定性定量鉴别提供了有效方法，对有效的鉴别和保护3种中药种质资源具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供鉴别皱果苋与2种常见混淆品的分子特异性标记引物及方法，该方法可快速简便的鉴别皱果苋、白苋、反枝苋。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：