[发明专利]猪GADD45a基因的新用途及高表达细胞系的构建和应用

权利要求书

1.一种高表达猪GADD45a基因的细胞系的构建方法，其特征是：包括以下步骤：

1）、根据猪GADD45a基因全长序列和LentiORF^TM-pLEX-MCS载体，简称pLEX-MCS，设计并合成含有酶切位点的GADD45a全长的扩增引物；

2）从小猪脂肪组织中扩增得到GADD45a基因全长序列，回收并酶切，与酶切后的pLEX-MCS连接，构建pLEX-MCS-GADD45a慢病毒质粒，单克隆测序鉴定并验证后，采用脂质体转染法将pLEX-MCS-GADD45a慢病毒质粒和pSPAX.2及pMD2.G共转染到293T细胞中，获得重组慢病毒；

3）采用步骤2）获得的重组慢病毒转染猪IPEC-J2细胞，获得高表达猪GADD45a基因的IPEC-J2细胞系。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征是：所述步骤2）中构建pLEX-MCS-GADD45a慢病毒质粒的验证：

取8×10⁵个/孔的密度接种于6孔细胞培养板中，然后用脂质体转染pLEX-MCS-GADD45a质粒，48小时后提取蛋白，用Western blot 法检测GADD45a和内参β-actin的表达。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征是：将步骤2）获得的重组慢病毒进行鉴定：

将重组慢病毒转染密度为70%~80%的293T细胞，48 h后用收集细胞，提取总蛋白并用Western blot 法检测目的基因GADD45a和内参β-actin蛋白表达情况。