[发明专利]猪GADD45a基因的新用途及高表达细胞系的构建和应用

说明书

本发明公开了猪GADD45a基因的新用途及高表达细胞系的构建和应用。根据猪GADD45a基因全长序列和载体pLEX‑MCS，设计并合成含有酶切位点的GADD45a全长的扩增引物；从小猪脂肪组织中扩增得到GADD45a基因全长序列，回收并酶切，与酶切后的pLEX‑MCS连接，构建pLEX‑MCS‑GADD45a慢病毒质粒，单克隆测序鉴定并验证后，采用脂质体转染法将pLEX‑MCS‑GADD45a慢病毒质粒和pSPAX.2及pMD2.G共转染到293T细胞中，获得重组慢病毒；采用步骤2）获得的重组慢病毒转染猪IPEC‑J2细胞，获得高表达猪GADD45a基因的IPEC‑J2细胞系。猪GADD45a基因的新用途，用于调控营养吸收代谢。本发明开拓了猪GADD45a基因的新功能及其在肠道上皮细胞中研究的新方法。

技术领域

本发明涉及猪GADD45a基因的新用途及高表达细胞系的构建和应用，属于生物和现代农业技术领域的应用技术。

背景技术

GADD45a（又叫DDIT1）是生长阻滞和DNA损伤诱导基因家族成员之一，是第一个被检出的p53的下游基因，是一个能够识别基因组损伤的重要生物标志物。参与调控细胞周期、细胞凋亡、细胞衰老和肿瘤发生发展等，在调控细胞周期、维持基因组稳定性、细胞凋亡、DNA 损伤修复以及信号传导等重要细胞生命活动中起重要作用。

猪GADD45a基因mRNA有1527bp，有4个外显子，编码序列全长为498bp，编码165个氨基酸，编码约18 kD的蛋白。但目前关于猪GADD45a的研究报道甚少。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供猪GADD45a基因的新用途及高表达细胞系的构建和应用。

一种高表达猪GADD45a基因的细胞系的构建方法，包括以下步骤：

1）、根据猪GADD45a基因全长序列和LentiORF^TM-pLEX-MCS载体，简称pLEX-MCS，设计并合成含有酶切位点的GADD45a全长的扩增引物；

2）从小猪脂肪组织中扩增得到GADD45a基因全长序列，回收并酶切，与酶切后的pLEX-MCS连接，构建pLEX-MCS-GADD45a慢病毒质粒，单克隆测序鉴定并验证后，采用脂质体转染法将pLEX-MCS-GADD45a慢病毒质粒和pSPAX.2及pMD2.G共转染到293T细胞中，获得重组慢病毒；

3）采用步骤2）获得的重组慢病毒转染猪IPEC-J2细胞，获得高表达猪GADD45a基因的IPEC-J2细胞系。

所述步骤2）中构建pLEX-MCS-GADD45a慢病毒质粒的验证：

取8×10⁵个/孔的密度接种于6孔细胞培养板中，然后用脂质体转染pLEX-MCS-GADD45a质粒，48小时后提取蛋白，用Western blot 法检测GADD45a和内参β-actin的表达。

将步骤2）获得的重组慢病毒进行鉴定：

将重组慢病毒转染密度为70%~80%的293T细胞，48 h后用收集细胞，提取总蛋白并用Western blot 法检测目的基因GADD45a和内参β-actin蛋白表达情况。

根据所述的构建方法得到的pLEX-MCS-GADD45a慢病毒质粒，和/或者重组慢病毒，和/或者高表达猪GADD45a基因的IPEC-J2细胞系。

根据所述的构建方法得到的pLEX-MCS-GADD45a慢病毒质粒，和/或者重组慢病毒，和/或者高表达猪GADD45a基因的IPEC-J2细胞系的用途，用于调控肠道紧密连接蛋白表达、细胞增殖、脂肪酸吸收，或者线粒体定位。

一种猪GADD45a基因的新用途，用于调控营养吸收代谢。

本发明的有益效果：