[发明专利]菠菜汁中金黄色葡萄球菌生长预测模型的建立方法

权利要求书

1.菠菜汁中金黄色葡萄球菌生长预测模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：分别将浓度为10⁶，10⁵，10⁴，10³，10²CFU/ml的金黄色葡萄球菌接种在25℃菠菜汁中，测得细菌数，使用Matlab软件对细菌数进行非线性回归分析，建立Gompertz一级模型，并根据对函数式的推导，拟合求解生长参数，所述的参数分别为：延滞期LPD和最大比生长速率U，根据获得的参数建立二级模型；

所述的Gompertz一级模型的一般形式为：

y＝a·exp[-exp(b-cx)]

分别以时间t作为横坐标，ln(N_t/N₀)作为纵坐标；

其中，N₀为初始菌数(CFU/ml)，N_t为t时刻的细菌数；

所述的二级模型描述菌液的初始浓度对一级模型参数的影响，包括：1)建立不同初始浓度下的最大比生长速率二级平方根模型；

其中a为-0.1381，b为1.451；

2)建立不同初始浓度下的延滞期二级平方根模型；

其中a为-0.2711，b为2.164；

具体步骤如下：

a)采用标准菌株为金黄色葡萄球菌ATCC 13565株；经过平板划线稀释获得的单菌落在胰蛋白酶大豆肉汤TSB中孵育后，加入1毫升的TSB和50％的甘油到离心管中，将培养物冷冻并保存在-80℃处备用；

b)在大豆酪蛋白琼脂TSA无菌平板上平行划线，37℃培养24～48h活化，挑取单菌落接种于含有100mL胰蛋白酶大豆肉汤TSB的锥形瓶中，充分混匀，将锥形瓶放入36℃培养箱，培养16.5h至初始菌落为10⁶CFU/mL，即原菌液，4℃保存备用；

c)将原菌液于4℃，8000g离心20min，得到细胞颗粒，用95％的生理盐水清洗两次，用已灭菌的鲜榨菠菜汁分别稀释至10⁶，10⁵，10⁴，10³，10²CFU/ml，将其分别存放到4℃，10℃，25℃；每隔适当的时间取出分装试管进行金黄色葡萄球菌的浓度测定；取1ml样品液于9ml生理盐水中进行充分震荡，然后使用生理盐水继续逐级稀释；将0.1ml稀释后的菌液涂抹在TSA固体平板上，置于37℃恒温箱24h，以获得葡萄球菌的总数；

d)利用Matlab软件进行非线性回归分析，通过Gompertz模型拟合不同温度下，不同接菌浓度下的生长曲线，建立初级生长模型；其中Gompertz模型的一般形式为：y＝a·exp[-exp(b-cx)]，分别以时间t和ln(N_(t)/N₀)为横、纵坐标；N₀为初始菌数(CFU/mL)，N_t为t时刻的细菌数，利用Matlab分析不同温度，不同初始浓度条件下鲜榨菠菜汁中金黄色葡萄球菌的生长数据，并根据对函数式的推导，求解描述微生物生长曲线特性的3个参数(U，LPD，A)：最大比生长速率U指对数期中拐点处的正切值，微生物生长的延滞期LPD是指该拐点处的切线与x轴的交点值，A＝ln(N_max/N₀)，Nmax是指稳定期微生物数量(CFU/mL)；

25℃下，Gompertz模型拟合的不同浓度金黄色葡萄球菌在鲜榨菠菜汁中的生长曲线，微生物生长的延滞期LPD是指该拐点处的切线与x轴的交点值；在初始菌浓度为10²，10³，10⁴时初始菌浓度越高，菌的延滞期越短，较快进入对数期，随着初始菌浓度的增高，曲线趋于平缓，则延滞期时间增加；最大比生长速率U指对数期中拐点处的正切值，对数期的生长比率随着菌浓度的增大而减小；

e)用Matlab软件拟合金黄色葡萄球菌在鲜榨菠菜汁中生长的Gompertz模型，得到相应的生长参数:最大比生长速率U(lgCFU/mL·h)、生长延滞期LPD(h)；

f)一级模型只能描述微生物生长数量变化与时间的关系，不能描述环境因素变化对微生物生长的影响，因此根据一级模型中得到不同初始浓度下的最大比生长速率，建立二级平方根模型，描述初始浓度对金黄色葡萄球菌的生长影响；采用平方根模型拟合温度生长速率曲线；平方根方程如下：式中：T为温度，T_min为的最低生长温度，b是方程的常数；

g)根据一级模型中得到10²～10⁶不同初始浓度下的生长延滞期，建立了延滞期平方根模型。