[发明专利]一种引物探针组合物及检测方法和用途

说明书

本发明涉及生物技术技术领域，具体涉及一种引物探针组合物及检测方法和用途，所述引物的核苷酸序列包括SEQ ID NO.1‑2和SEQ ID NO.7‑8中的至少两种，所述探针的核苷酸序列包括SEQ ID NO.3‑6和SEQ ID NO.9‑12中的至少两种，所述引物探针组合物可用于检测SNCA基因DNA甲基化水平，用于制备诊断或监测帕金森病及其相关疾病发生发展的产品。本发明具有成本低，操作简单的优点，提高了检测的效率，在全封闭状态下进行PCR扩增和产物分析，杜绝了普通PCR开放检测对环境和样本的污染，并且可定量分析SNCA基因DNA甲基化水平。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种引物探针组合物及检测方法和用途。

背景技术

α-突触核蛋白是一种在中枢神经系统突触前及核周表达的可溶性蛋白质，它与帕金森病的发病机制和相关功能障碍密切相关。中枢神经系统是神经系统中神经细胞集中的结构，在脊椎动物包括脑和脊髓；在高等无脊椎动物如环节动物和昆虫等，则主要包括腹神经索和一系列的神经节。人的中枢神经系统构造最复杂而完整。

SNCA基因编码的α-突触核蛋白是由140个氨基酸组成，分子量为19kDa的高度保守的小分子蛋白质，主要存在于神经元突触前末梢，具有调节神经递质的释放和再摄取、突触囊泡再循环等功能。α-突触核蛋白在神经元中的作用与其浓度密切相关，低浓度时对神经元有保护作用，高浓度或过表达时对神经元有细胞毒性作用。

大量研究表明SNCA基因在帕金森病的发生发展中发挥着重要作用。首先，α-突触核蛋白是帕金森病病理标记物路易小体的重要组成部分；其次，SNCA突变以及拷贝数变异能够导致家族性帕金森病，而其基因多态性是散发帕金森病的危险因素；第三，SNCA突变、α-突触核蛋白过表达、α-突触核蛋白寡聚体能够引起模式动物产生帕金森样病理改变。

SNCA基因定位于人染色体4q21-23上(NC_000004.12，89724099-89838324)，跨度大约110kb，包含有6个外显子和若干内含子，SNCA基因启动子以及第一外显子区富含GC，存在典型的CpG岛结构。

CpG岛区的DNA甲基化修饰几乎存在于所有高等生物中。DNA甲基化可以关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。在哺乳动物中，DNA发生甲基化仅在CpG的胞嘧啶上，在DNA甲基化修饰转移酶(DNMTs)的作用下，使5’-CpG-3’二核苷酸5′端的胞嘧啶生成5-甲基胞嘧啶(m5c)。这种DNA修饰方式并没有改变基因序列，但可调控基因的表达，甲基化程度与转录活性呈反比。DNA甲基化是研究最为深入的表观遗传学机制，其在维持正常细胞功能、染色质结构修饰、X染色体失活、基因组印迹、胚胎发育以及人类肿瘤发生起着重要作用。

研究表明，帕金森及其相关疾病患者外周血基因组DNA中SNCA基因启动子以及第一外显子区的CpG岛出现了显著的低甲基化。这一低甲基化可能引起α-突触核蛋白表达的升高，并进一步促进帕金森及其相关疾病的发生发展。大量研究提示，通过分析该区域的甲基化水平，能够辅助帕金森及其相关疾病的早期预警、诊断和鉴别诊断。因此，针对该区域甲基化，建立一种简单、高通量、易于临床检测、成本低廉的检测方法非常重要。

甲基化检测方法主要有亚硫酸盐二代测序法、亚硫酸盐一代测序法、焦磷酸测序法以及甲基化特异PCR。其中亚硫酸盐二代测序法成本较高，不适用大规模应用；亚硫酸盐一代测序法操作步骤多，费时费力；焦磷酸测序法通量高，可定量分析，但操作步骤较多；甲基化特异PCR法较为简单，但仅可定性分析。

中国专利申请CN106636306A公开了一种用于结直肠癌中相关基因启动子甲基化的检测方法，其中一种荧光PCR定性检测基因SNCA的甲基化引物及探针序列分别为上游引物GCGTTTTGGGCGTTTTTTTAC，下游引物CGCTATAAACCGACGACGC，探针6FAM-CGCTAACCTATCGTCGAA-MGB。但是该专利申请主要是利用SNCA等相关基因的甲基化程度辅助诊断结直肠癌，所公开的引物和探针对于帕金森及其相关疾病没有任何辅助诊断作用。