[发明专利]一种L-赖氨酸产量提高的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法

权利要求书

1.一种L-赖氨酸产量提高的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述的重组谷氨酸棒杆菌是在谷氨酸棒杆菌宿主菌中，将dapA基因的启动子序列PdapA突变为如SEQ ID NO.4所示的序列，将dapB基因的启动子序列PdapB突变为如SEQ ID NO.9所示的序列，并将ddh基因的启动子序列Pddh突变为如SEQ ID NO.10所示的序列；

所述的谷氨酸棒杆菌宿主菌为谷氨酸棒杆菌CGGA0T，所述的谷氨酸棒杆菌CGGA0T是在谷氨酸棒杆菌CICC 23604中异源表达来源于丙酮丁醇梭菌ATCC824的磷酸甘油醛脱氢酶编码基因gapC，并敲除高丝氨酸激酶编码基因thrB。

2.一种权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）构建突变启动子的整合片段：合成含有PdapA突变启动子基因的dapA上下游同源臂片段融合得到重组片段mdapA，合成含有PdapB突变启动子基因的dapB上下游同源臂片段融合得到重组片段mdapB，合成含有Pddh突变启动子基因的ddh上下游同源臂片段融合得到重组片段mddh；

（2）构建重组质粒：分别将重组片段与含有sgRNA的线性化载体连接，分别得到含重组片段mdapA的重组质粒、含重组片段mdapB的重组质粒和含重组片段mddh的重组质粒；

（3）构建重组谷氨酸棒杆菌：将含有cas9蛋白的质粒转化谷氨酸棒杆菌宿主菌，得到谷氨酸棒杆菌CGCas9，然后将重组质粒依次转化谷氨酸棒杆菌CGCas9，去除外源质粒，得到重组谷氨酸棒杆菌。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的含有cas9蛋白的质粒包括pFSC质粒。

4.权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌在生产L-赖氨酸中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的应用是将重组谷氨酸棒杆菌在发酵培养基中培养60~80h得到所述的L-赖氨酸，所述的发酵培养基（g/L）：葡萄糖80~100，糖蜜15~25，硫酸铵 50~70，豆粕水解液35~45，七水硫酸镁 1.0~1.5， 磷酸二氢钾 1.0~1.2， 醋酸铵2~4，碳酸钙 15~25，MgSO₄•7H₂O 0.20~0.3，CaCl₂ 0.01~0.02，FeSO₄•7H₂O 0.01~0.02，MnSO₄•H₂O 0.03~0.05，ZnSO₄•7H₂O 0.02~0.04，CuSO₄•5H₂O 0.001~0.003，NiCl₂•6H₂O0.0020~0.0025，生物素 0.001~0.003。