[发明专利]一种L-赖氨酸产量提高的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法

说明书

本发明公开了一种L‑赖氨酸产量提高的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法。本发明的重组谷氨酸棒杆菌是在谷氨酸棒杆菌宿主菌中，将dapA基因的启动子序列PdapA突变为如SEQ ID NO.4～6所示的序列中的一种，将dapB基因的启动子序列PdapB突变为如SEQ ID NO.7～9所示的序列中的一种，并将ddh基因的启动子序列Pddh突变为如SEQ ID NO.10～12所示的序列中的一种。本发明通过对L‑赖氨酸生物合成途径相关基因的改造，构建得到27株重组菌CGL3‑1～CGL3‑27，其中CGL3‑7使得L‑赖氨酸的产量得到了显著提高，达到了62g/l，是原始菌株的的产量的1.48倍。本发明提供了一种改造微生物中L‑赖氨酸生物合成途径提高L‑赖氨酸产量的方法，为构建L‑赖氨酸的高产菌株提供了理论依据。

技术领域

本发明涉及一种L-赖氨酸产量提高的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

L-赖氨酸是八大必需氨基酸之一，是人和动物必需的、自身不能合成的氨基酸。L-赖氨酸具有平衡氨基酸组成、调节体内代谢平衡、提高机体对谷类蛋白质的吸收及利用率和促进机体生长发育等功能，因此被广泛应用于饲料、医药及食品工业中。

目前，L-赖氨酸生产主要有化学合成法、蛋白水解法和微生物发酵法，其中微生物发酵法生产成本低、生产强度高、对环境污染小，因而成为目前工业生产L-赖氨酸应用最广泛的方法。目前生产L-赖氨酸的常用菌株包括大肠杆菌、黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌，其中谷氨酸棒杆菌为食品安全级菌株，但其在摇瓶水平的L-赖氨酸产量一直未得到大幅提升。

谷氨酸棒杆菌CICC 23604已经被广泛应用于工业发酵生产各类氨基酸，其产品被FDA认证为“generally regarded as safe”(GRAS)安全级别。因此，运用代谢工程手段构建重组谷氨酸棒杆菌是生产食品安全级L-赖氨酸的有效途径。目前，利用表达质粒介导的氨基酸合成途径中关键性酶基因的过表达是对谷氨酸棒杆菌进行基因改造的主要手段。然而利用表达质粒介导基因过表达必将在谷氨酸棒杆菌细胞内引入抗生素抗性基因并在生长过程中添加一定的抗生素，引起人们对抗生素使用的疑虑。因此，提供一种安全高效的对谷氨酸棒杆菌进行遗传改造的方法，对于生产食品安全级L-赖氨酸有重要的意义。在前期工作中，我们以谷氨酸棒杆菌CICC 23604作为出发菌株，采用CRISPR-Cas9基因编辑技术，异源表达来源于丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum ATCC824)的磷酸甘油醛脱氢酶编码基因gapC，提高胞内NADPH供给；敲除高丝氨酸激酶编码基因thrB，减少发酵过程副产物苏氨酸的积累，得到积累L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌基因工程菌，产量达到42g/l。但是L-赖氨酸产量还有待进一步提高，更加适用于工业化生产。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种L-赖氨酸产量提高的重组谷氨酸棒杆菌，以谷氨酸棒杆菌CGGA0T为出发菌株，利用基因随机突变试剂盒随机突变L-赖氨酸合成相关基因dapA、dapB和ddh的启动子序列，并筛选出最适组合得到高产L-赖氨酸的重组谷氨酸棒杆菌CGL3-7。

本发明的第一个目的是提供一种L-赖氨酸产量提高的重组谷氨酸棒杆菌，所述的重组谷氨酸棒杆菌是在谷氨酸棒杆菌宿主菌中，将dapA基因的启动子序列PdapA突变为如SEQ ID NO.4～6所示的序列中的一种，将dapB基因的启动子序列PdapB突变为如SEQ IDNO.7～9所示的序列中的一种，并将ddh基因的启动子序列Pddh突变为如SEQ ID NO.10～12所示的序列中的一种。

进一步地，所述的谷氨酸棒杆菌宿主菌为谷氨酸棒杆菌CGGA0T，所述的谷氨酸棒杆菌CGGA0T是在谷氨酸棒杆菌CICC 23604中异源表达来源于丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum ATCC824)的磷酸甘油醛脱氢酶编码基因gapC，并敲除高丝氨酸激酶编码基因thrB。