[发明专利]一种脂肪酶突变体及其在制备(S)-2-氯苯甘氨酸甲酯中的应用

说明书

本发明公开了一种脂肪酶突变体及其在制备(S)‑2‑氯苯甘氨酸甲酯中的应用，该脂肪酶突变体由SEQ ID No.2所示氨基酸序列第157位的谷氨酰胺突变为苯丙氨酸，第189位的异亮氨酸突变为赖氨酸，且第154位的缬氨酸突变为天冬氨酸而获得。本发明通过分子对接和定点饱和突变，筛选获得了可明显缩短不对称水解反应时间且对R型2‑氯苯甘氨酸甲酯方拆分效率高、选择性高的脂肪酶突变体，该突变体在反应12h后(S)‑2‑氯苯甘氨酸甲酯的得率达到了72.81％，ee值为95.24％，相对于野生型来说，实现了活性的提高和选择性的反转，同时缩短了反应时间。

技术领域

本发明涉及酶基因改造技术领域，具体涉及一种脂肪酶突变体及其在拆分(R,S)-2-氯苯甘氨酸甲酯制备单一对映体(S)-2-氯苯甘氨酸甲酯中的应用。

背景技术

南极假丝酵母(Candida antarctica)是在南极洲分离得到的一种酵母菌，该菌株可以合成出CALA和CALB两种不同的脂肪酶。早在1994年之前，人们就成功的分离出了这两种脂肪酶，并对其氨基酸序列和三维结构进行了研究，发现南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)总共具有317个氨基酸，分子量为33kDa。

到目前为止，CALB被研究人员大量的在米曲霉、毕赤酵母、酿酒酵母和大肠杆菌中进行克隆表达，成为了商业上应用较为广泛的一种酶。但是，野生型的CALB仍然具有一定的缺陷，如热稳定性较差和产量较低等，对CALB进行修饰和改造使其具有更加良好的性质是较为热门的一个研究。

2-氯苯甘氨酸甲酯(2-Chlorophenylglycine methyl ester)是一种具有生物活性的非天然的氨基酸酯，由2-苯甘氨酸与甲醇经酯化合成得到，其作为一种医药中间体，是目前合成高效抗血小板凝集类药物氯吡格雷(Clopidogrel)的重要途径之一。该药物商品名为“波立维(Plavix)”，主要功能为抑制ADP诱导的血小板凝集，在血栓和心脑血管疾病治疗上有着重要的作用。

氯吡格雷属于手性类药物，从临床实验研究结果中发现，(S)-氯吡格雷具有抗血小板凝集的活性，但(R)-氯吡格雷没有显示出相同的活性，并且有研究证明(S)-氯吡格雷的耐受性比(R)-氯吡格雷高约40倍。

对于手性药物来说，手性与药物的药理活性、毒性和药代动力学有着密切的关联，高纯度单一对映体具有治疗靶点明确，疗效更高、安全性更高等优势。因此，作为合成氯吡格雷的重要原料，获取单一对映体的2-氯苯甘氨酸甲酯对氯吡格雷的生产和使用有着重要的意义。

目前，外消旋2-氯苯甘氨酸甲酯主要使用化学法进行拆分，主要使用的拆分剂为酒石酸和樟脑磺酸，向溶解于甲醇的外消旋邻氯苯甘氨酸甲酯中加入等体积的拆分剂，随后利用非对映体盐拆分等方法进行拆分，其能获得ee值达到99％以上的产物，产率在31％～45％，但其具有拆分剂添加量大、产废量多、拆分成本高、反应时间长、原料浪费现象严重和操作过程繁琐等缺陷。所以，开发一种高效、低成本且绿色环保的2-氯苯甘氨酸甲酯拆分方法是有着重要意义的。

生物催化制备医药中间体是近年来研究较为热门的一个领域，相对于使用化学法获取2-氯苯甘氨酸甲酯，使用酶催化方法表现得更加环保高效且低成本。目前的专利文献对于利用酶直接拆分2-氯苯甘氨酸甲酯的研究报道还较少，2009年黄淳旭等人研究了使用碱性蛋白酶拆分邻氯苯甘氨酸甲酯，在反应24h后得到了ee值达到99.8％的(S)-2-氯苯甘氨酸甲酯。2014年薛屏等人使用固定化青霉素G酰化酶拆分30h后得到了ee值为97.1％的产物，但还是存在反应时间长等缺陷。

野生型的南极假丝酵母脂肪酶B对2-氯苯甘氨酸甲酯几乎没有或仅有很低的对映选择性，但是随着对南极假丝酵母的氨基酸序列及晶体结构研究的深入，发现对CALB进行适当地修饰和改进可以提升CALB的选择性，并大大加快反应进程，从而达到快速拆分2-氯苯甘氨酸甲酯的目的。

发明内容