[发明专利]一种酶法制备恩沙替尼中间体的方法在审
| 申请号： | 202010036605.1 | 申请日： | 2020-01-14 |
| 公开（公告）号： | CN111118072A | 公开（公告）日： | 2020-05-08 |
| 发明（设计）人： | 唐云平;肖延铭;张飞龙;严燕兵;葛文强;梁阿朋 | 申请（专利权）人： | 长兴制药股份有限公司 |
| 主分类号： | C12P7/22 | 分类号： | C12P7/22;C12N9/04;C12N15/53;C12N15/70 |
| 代理公司： | 浙江千克知识产权代理有限公司 33246 | 代理人： | 黎双华 |
| 地址： | 313100 浙*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 法制 备恩沙替尼 中间体 方法 | ||
1.一种酶法制备恩沙替尼中间体的方法，其特征在于，所述方法以2,6-二氯-3-氟苯基乙酮为底物，在羰基还原酶、辅因子及氢供体的存在下，发生不对称还原反应生成(R)-2,6-二氯-3-氟苯基乙醇，所述羰基还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述羰基还原酶的DNA序列如SEQ NO.1所示。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述羰基还原酶的制备方法为：将SEQ IDNO.1所示羰基还原酶基因连接到pET26b(+)上，获得重组表达载体pET26b-CS-ADH，将重组表达载体pET26b-CS-ADH通过热激转化法转到表达菌株BL21(DE3)中，将单菌落接入到含卡那霉素的LB培养液中培养，37℃过夜培养，得菌种液，将菌种液加入含卡那霉素的TB培养基中，在37℃条件下振荡培养至OD600至2.5，然后添加IPTG至IPTG的终浓度为0.1mM，25℃下诱导培养8-10h，离心，收集菌体，超声破壁后即获得重组羰基还原酶。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述底物2,6-二氯-3-氟苯基乙酮的浓度为10-25g/L。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组羰基还原酶的使用量为10-50g/L。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述辅因子为NAD+，其浓度为0.05-0.1g/L。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氢供体为葡萄糖，葡萄糖与底物的摩尔比是1.2∶1。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述不对称还原反应在缓冲液中进行，缓冲液为磷酸缓冲液，pH为7.0-7.5。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述不对称还原反应的温度为30-35℃；反应时间为8-12h。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的产物(R)-2,6-二氯-3-氟苯基乙醇的结构式如下：
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