[发明专利]一种高效体外扩增培养具有强杀伤力的自然杀伤性细胞的方法

权利要求书

1.一种高效体外扩增培养具有强杀伤力的自然杀伤性细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：

a.载体构建：构建过表达4-1BBL和IL-15的载体；

b.病毒包装：采用步骤a中构建的质粒包装慢病毒，检测病毒滴度；

c.K562细胞的感染与制备：采用步骤b中的病毒对K562细胞进行感染，检测4-1BBL表达效率和IL-15表达效率；

d.灭活K562细胞：采用X-ray照射K562细胞；

e.收集单个核细胞：抽取健康人外周血，利用梯度离心方法富集外周血单个核细胞；

f.预扩增自然杀伤性细胞：利用NK细胞培养基培养外周血单个核细胞，获得超过50%的NK细胞；

g.采用步骤d中的K562细胞，体外刺激步骤f中的NK细胞活化和扩增；

h.利用CD56磁珠富集NK细胞。

2.根据权利要求1所述的一种高效体外扩增培养具有强杀伤力的自然杀伤性细胞的方法，其特征在于：步骤a中，表达4-1BBL的载体包括4-1BBL基因的CDS编码区，其中包含4-1BBL基因信号肽；表达IL-15的载体包括IL-15基因的CDS编码区，其中包含IL-15基因信号肽。

3.根据权利要求1所述的一种高效体外扩增培养具有强杀伤力的自然杀伤性细胞的方法，其特征在于：步骤d中，K562细胞经过铯照射源半致死剂量照射，使K562细胞丧失增殖能力；所述K562细胞包括K562细胞、过表达4-1BBL的K562细胞和过表达IL-15的K562细胞。

4.根据权利要求1所述的一种高效体外扩增培养具有强杀伤力的自然杀伤性细胞的方法，其特征在于：步骤e中抽取健康人外周血10ml，10ml外周血为起始采血量。

5.根据权利要求1所述的一种高效体外扩增培养具有强杀伤力的自然杀伤性细胞的方法，其特征在于：步骤g中，外周血单个核细胞与灭活的过表达4-1BBL的K562细胞和/或灭活的过表达IL-15的K562细胞共培养。

6.根据权利要求1所述的一种高效体外扩增培养具有强杀伤力的自然杀伤性细胞的方法，其特征在于：步骤h中，获得的NK细胞同时具备CD45和CD56；最终获得的细胞群体中CD56+细胞含量大于98%。

7.根据权利要求1所述的一种高效体外扩增培养具有强杀伤力的自然杀伤性细胞的方法，其特征在于：步骤h中，获得的NK细胞具有强烈的杀伤肿瘤细胞能力。