[发明专利]一种从哺乳动物粪便中高效富集宿主DNA的方法

说明书

一种从哺乳动物粪便中高效富集宿主DNA的方法，属于分子生物学技术领域。针对目前哺乳动物粪便样本提取DNA时，宿主DNA富集效率低、对陈旧粪便提取效果差、大量细菌DNA的残留严重干扰后续反应，而且成本居高不下等问题，本发明提供了一种从粪便中高效富集宿主DNA的方法，在提取前，对粪便样本进行SDS预处理：将粪便样本与10mmol/L磷酸缓冲液PBS溶液混合后，加入SDS溶液至终浓度为0.01％～5％(质量)混匀，在室温下静置1min～30min；然后离心取上清，从上清液中提取DNA。本发明成本低廉，不受样本数量的限制，拓展了粪便样本在动物研究和保护监测中的应用。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种从哺乳动物粪便中高效富集宿主DNA的方法。

背景技术

近年来，非损伤性取样在保护生物学以及分子生态学中的应用得到了广泛的关注和重视，而粪便由于：(1)可以非损伤性地获取研究对象的肠上皮细胞，具有无创、无痛、无侵害性的优点；(2)动物排便具有常规性和节律性，因此粪便样品的数量充足，相比较于其他样本类型而言可提供足量的样本来源；(3)粪便样本可以在不触及甚至在看不到动物实体的情况下进行采集，尤其在针对凶猛大型食肉动物的情况下，可最大程度地保证采样人员的安全，同时也将采集过程中对动物的干扰降至最低；(4)粪便采集容易操作，成本较低。因此粪便是野外动物研究和动物园等人工饲养动物管理中最为常用的样品。通过从粪便中存在的宿主肠道上皮细胞中提取出的宿主DNA，在物种鉴定、交配系统分析、遗传多样性评价、种群遗传结构分析、系统地理学研究等方面都发挥着重要作用。

研究表明，每克新鲜粪便中含有10⁵个肠上皮细胞，其中大多数仍然保持完整，继续维持正常的生命活动，然而粪便干重的55％以上由细菌构成，这些细菌来源于肠道菌群和周边环境。因此从粪便中提取的总DNA中，宿主DNA的含量极少，且常常含有抑制分子生物学反应的物质，导致后续实验的分析成功率很低，尤其对于核基因组的分析更是困难，如微卫星和SNP分型结果的确认不得不反复重复多次，不仅大大增加了实验成本，而且还严重了影响数据的可靠性。

因此，如何提高粪便中宿主DNA的提取效率，降低细菌DNA所占的比例是目前粪便DNA提取技术中的关键。现今针对粪便中宿主DNA富集的方法主要有DNA甲基化免疫共沉淀技术、密度梯度离心法、免疫磁珠分选法、介电泳分离法(DEP)、商业化粪便DNA提取试剂盒等，上述方法中存在如下特点和缺陷：

(1)宿主DNA的富集效率仍然不够理想，尤其对于核基因组的富集更加困难。

就DNA甲基化免疫共沉淀技术而言，该种方法可以富集到高纯度的宿主核基因组的甲基化片段，但是由于宿主线粒体基因组发生甲基化的概率很小，所以该种方法无法实现对线粒体遗传物质的富集；就免疫磁珠法，介电泳芯片法而言，该类方法对宿主DNA的富集可以达到很高的纯度，但由于细菌DNA的数量过于庞大，干扰严重，对宿主细胞的捕获概率很低，最终造成获得的宿主DNA的富集量较少；目前应用最为广泛的是Qiagen公司推出的QIAamp试剂盒，总体上对宿主线粒体基因组的富集效果尚可满足大多数实验需要，但对宿主核DNA的富集效果仍旧不够理想，在进行微卫星位点检测时，同一个样本至少要重复5～7次，按照以“少数服从多数”的方式获得最终分型结果，准确度很低。

(2)对于陈旧粪便而言宿主DNA提取效率更差。

现今应用的各种粪便中宿主DNA的富集技术，基本上都更适合于新鲜粪便，尤其对于SCSR-TTM试剂盒、甲基化共沉淀法、磁珠分选法、介电泳芯片法以及密度梯度离心法等，对于粪便样本的新鲜程度要求更为严格。目前，虽然QIAamp试剂盒对样本的新鲜程度要求相对宽泛，但对陈旧粪便中宿主DNA的富集效果并不理想。

(3)成本高，消耗大。