[发明专利]一种农杆菌介导的青海芥菜型多室油菜的遗传转化方法

权利要求书

1.一种农杆菌介导的青海芥菜型多室油菜的遗传转化方法，其特征在于，受体材料为青海芥菜型多室油菜，选用农杆菌介导下胚轴转化法，将BjuA07.CLV1转入青海芥菜型多室油菜，转化过程需5个培养世代，M₀～M₄。

2.根据权利要求1所述的农杆菌介导的青海芥菜型多室油菜的遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、种子消毒：种子充分干燥后，取饱满的种子，置于灭菌培养盒，灭菌蒸馏水漂洗1遍；76％酒精消毒2min；0.1％的升汞溶液消毒12min；灭菌蒸馏水漂洗6遍，每次1min；

步骤2、播种：消毒的种子，置于培养基M₀上，24℃，暗光培养5d；

步骤3、农杆菌活化：含构建包含BjuA07.CLV1基因的载体的农杆菌菌液于含双抗Kanamycin和Gentamicin的LB固体培养基中划线培养，于28℃恒温箱内培养2d，菌落进行PCR鉴定，阳性菌液，于28℃，180r/min摇菌16～20h，摇浑的菌液吸30uL接种到50mlKanamycin+Gentamicin+液体LB中，摇至OD₆₀₀＝0.1～0.2，摇12～14h；4000r/min离心收集菌体，加等体积DM悬浮液悬浮菌体；

步骤4、浸染：生长5d的幼苗下胚轴长为8cm，用灭菌镊子和解剖刀将下胚轴切为长度为0.8～1.0cm片段，保证切口平整，浸泡于DM稀释的农杆菌溶液20～30min，用灭菌滤纸吸干菌液，将小段下胚轴转移至M₁培养基中，于22℃恒温培养箱内，遮光培养40h；

步骤5、共培养：M₁遮光40h后转移至M₂诱导愈伤培养基，共培养3周；

步骤6、芽再生：M₂培养基中生长20d后，下胚轴两端膨大，将其转入M₃芽再生培养基，共培养15d继代一次，直至下胚轴两端出现绿芽；

步骤7、生根：M₃培养基中生长一个月后，下胚轴两端依次分化出绿芽，将含有生长点的绿芽转移到M₄生根培养基，待长出根系后移入营养土中；

步骤8、待植株长出5片叶后，提取DNA，进行阳性苗的PCR鉴定；

步骤9、待植株形成角果后，观察表型。

3.根据权利要求1所述的农杆菌介导的青海芥菜型多室油菜的遗传转化方法，其特征在于，播种培养基M0：MS 4.4g/L﹢Basic Agar 12g/L；

预培养基M₁：MS 4.4g/L﹢Sucrose 30g/L﹢Agarose 6g/L﹢Manitol 18g/L﹢2,4-D 1mg/L﹢Kinetin 0.3mg/L﹢AS 100mg/L；

共培养基M₂：MS 4.4g/L﹢Sucrose 30g/L﹢Agarose 6g/L﹢Manitol 18g/L﹢2,4-D 1mg/L﹢Kinetin 0.3mg/L﹢STS 30mg/L﹢Timentin 300mg/L﹢Kanamycin 25mg/L；

分化培养基M₃：MS 4.4g/L﹢Glucose 10g/L+Xylose 0.25g/L+MES 0.6g/L+Zeatin 2mg/L+IAA 0.1mg/L﹢Timentin 300mg/L﹢Kanamycin 25mg/L；

生根培养基M₄：MS 4.4g/L﹢Sucrose 10g/L﹢Agarose 6g/L。