[发明专利]一种农杆菌介导的青海芥菜型多室油菜的遗传转化方法

说明书

本发明公开了一种农杆菌介导的青海芥菜型多室油菜的遗传转化方法，包括以下步骤：受体材料为青海芥菜型多室油菜，选用农杆菌介导下胚轴转化法，将BjuA07.CLV1转入青海芥菜型多室油菜，转化过程需5个培养世代，M₀～M₄。本发明可根据春油菜种植的特殊地理位置所表现的温度，湿度和光阶值，建立芥菜型油菜的遗传转化体系，以此，为芥菜型油菜高效分化体系提供更多参考。

技术领域

本发明属于农业技术领域，涉及一种农杆菌介导的青海芥菜型多室油菜的遗传转化方法。

背景技术

当前世界油菜研究和生产发展的方向是优质、高产、高效,以提高油菜产业的综合经济效益。随着种植业结构调整的日趋深入，在保证粮食安全的前提下，要求油菜生产必须依靠科技、主攻单产、提高比较效益，实现产量增加、质量提升、效益提高的目标。在国家扶持政策的大力支持和鼓励下，我国粮食连年增产，2008年总产达到10574亿斤，也只是实现了8年来首次产需平衡，但粮食播种面积、人均粮食占有量仍呈下降趋势。同时我国食用植物油自给率持继下滑，由1998年的62％下降到2008年的42％，供给安全严重威胁国家的稳定，在保持现有耕地面积的情况下，要进一步增加粮油生产总量。

油菜是我国重要的油料作物之一,每年大约有40-42％的食用植物油来源于油菜。培育优质高产的油菜品种是当前育种工作者的首要目标。多室角果油菜相比于两室角果油菜,其每果粒数显著增多,在油菜适宜密植、直播及机械化操作等生产与遗传改良中,多室性状无疑具有重要作用。目前已报道的多室油菜类型有白菜型油菜和芥菜型油菜。

发明内容

本发明的目的在于提供一种农杆菌介导的青海芥菜型多室油菜的遗传转化方法。

其具体技术方案为：

一种农杆菌介导的青海芥菜型多室油菜的遗传转化方法，受体材料为青海芥菜型多室油菜，选用农杆菌介导下胚轴转化法，将BjuA07.CLV1转入青海芥菜型多室油菜，转化过程需5个培养世代，M₀～M₄。

进一步，包括以下步骤：

1.种子消毒：种子充分干燥后，取饱满的种子，置于灭菌培养盒，灭菌蒸馏水漂洗1遍；76％酒精消毒2min；0.1％的升汞溶液消毒12min；灭菌蒸馏水漂洗6遍，每次1min。

2.播种：消毒的种子，置于培养基M₀上，24℃，暗光培养5d。

3.农杆菌活化：农杆菌菌液，于含双抗(Kanamycin和Gentamicin的LB固体培养基中划线培养，于28℃恒温箱内培养2d，菌落进行PCR鉴定，阳性菌液，于28℃，180r/min摇菌16～20h，摇浑的菌液吸30μl接种到50ml(Kanamycin+Gentamicin)液体LB中，摇至OD600＝0.1～0.2(12～14h)。4000r/min离心收集菌体，加等体积DM(含AS终浓度为0.05mM)悬浮液悬浮菌体。

4.浸染：生长5d的幼苗下胚轴长约8cm左右，用灭菌镊子和解剖刀将下胚轴切为长度约0.8～1.0cm片段，保证切口平整，浸泡于DM稀释的农杆菌溶液约20～30min，用灭菌滤纸吸干菌液，将小段下胚轴转移至M₁培养基中，于22℃恒温培养箱内，遮光培养40h。

5.共培养：M₁遮光40h后转移至M₂诱导愈伤培养基，共培养(16/8h)3周左右。

6.芽再生：M₂培养基中生长20d左右后，下胚轴两端膨大，将其转入M₃芽再生培养基，共培养15d左右继代一次，直至下胚轴两端出现绿芽。