[发明专利]固定化酶、其制备方法及应用

说明书

本发明公开了一种固定化酶、其制备方法及应用。其中，该制备方法包括以下步骤：采用聚乙二醇修饰交联剂，得到聚乙二醇修饰的交联剂；将游离的酶沉淀，然后加入聚乙二醇修饰的交联剂进行交联固定得到固定化酶。应用本发明的技术方案，采用聚乙二醇修饰的交联剂对酶进行固定，固定后作为无载体固定化酶具有更好的稳定结构，具有更强的机械稳定性。

技术领域

本发明涉及生物催化技术领域，具体而言，涉及一种固定化酶、其制备方法及应用。

背景技术

生物催化已经成为重要药物部分、结构单元和中间体的绿色合成最有前景和最有利的技术之一，特别是为手性合成提供了独特的替代途径。合成化学家对连续流合成的兴趣日益增加，现在引起了对生物转化的关注。在工业过程中越来越多地使用酶作为催化剂导致对固定化形式的酶的需求增加，因为它提供了独特的工艺和成本优势。通常称为“生物催化剂”的固定化酶广泛用于工业有机合成和生物转化。

生物催化剂可以使用全活细胞、死细胞、粗酶或纯化酶来生产，这取决于酶的类型和应用。酶的可扩大生产和蛋白质工程的进步使得生物催化剂有可能实现商业化应用，并且具有较好的经济价值。

新型固定化平台的出现使得固定化酶在连续流动生物催化中完美整合。新型高效酶的发现和进化、强调生物催化的新型反向合成方法、降低的重组蛋白成本和酶固定化策略等都是生物催化在连续合成中应用的良好基础。

从概念上讲，制备固定化酶所用的固定主要包括物理吸附、载体结合、包埋和交联等方法。其中，物理吸附依赖于酶与载体的亲和力，虽然简单，但相互作用很弱，酶很容易被解吸和丢失；载体结合涉及通过离子键或共价键将酶连接到水不溶性载体上，该方法具有由于强化学键而使酶分子部分失活的缺点，目标酶也需要更纯化的形式，这最终增加了催化剂生产的成本。

近年来，在各种固定技术中，无载体，自交联酶固定化变得越来越重要。在过去的几十年中，无载体交联酶技术成为增强酶稳定性的有吸引力的方法[Roy et al，2004]。在该技术中，酶通过双功能交联剂交联，形成稳定的多相生物催化剂，明显优于常规固定化酶。通常使用各种载体的固定化酶是“载体结合的生物催化剂”，并且大部分非催化载体(总质量的约90～99％)的存在导致其体积活性的稀释。而被称为“无载体生物催化剂”的交联酶每单位体积表现出非常高的催化活性，从而使体积生产率和时空产率最大化[Sheldon等2005]。

目前，有关于固定脂肪酶、青霉素酰基转移酶、蛋白酶及氨基酰化酶等的无载体方法的已有报道，但是在其他敏感酶或新出现的酶如单加氧酶、氨裂解酶、烯还原酶、亚胺还原酶、转氨酶、酮还原酶、氨基酸脱氢酶及腈水解酶等制作成固定化酶的应用几乎没有报道。

另外，目前无载体固定化酶的缺点包括：在没有固体支持的情况下，无载体固定化酶尚不能完全扩展到大批量生产，因为它们对剪切应力和苛刻的搅拌条件表现出低机械稳定性，并且还可能引起过滤问题。当在分批搅拌反应中进行生物转化时，STY(空间-时间产率)相当低，这将导致相对低的生产率，而连续流动反应可以显着改善STY，从而得到更高的生产率、可控性及环境友好性。

因此，继续开发一种具有较强机械稳定性的无载体固定化酶。

发明内容

本发明旨在提供一种固定化酶、其制备方法及应用，以提高固定化酶的机械稳定性。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种固定化酶的制备方法。该制备方法包括以下步骤：采用聚乙二醇修饰交联剂，得到聚乙二醇修饰的交联剂；将游离的酶共沉淀，同时加入聚乙二醇修饰的交联剂进行交联固定得到固定化酶。

进一步地，采用聚乙二醇修饰交联剂的步骤包括：交联剂与聚乙二醇混合，得到聚乙二醇修饰的交联剂；优选的，聚乙二醇为PEG 2000～PEG 6000；优选的，聚乙二醇与所以交联剂的质量比为1:5～5:1，更有选的，质量比为1:2～3:1；优选的，交联剂为戊二醛或醛基化右旋糖苷；优选的，在室温下混合3～20小时。