[发明专利]鉴别甲状腺良恶性结节的基因片段及其应用

说明书

本发明提供一种用于甲状腺结节良恶性鉴别的组合物，所述组合物包括分别用于检测待检样品中与甲状腺结节良恶性相关的甲基化区域的BIN1基因的核酸序列和DNM2基因的核酸序列，以及内参基因的核酸序列。本发明还提供所述组合物在甲状腺结节良恶性鉴别中的应用。

技术领域

本发明属于分子辅助诊断领域，涉及鉴别甲状腺良恶性结节的基因片段及其应用，具体涉及BIN1基因和DNM2基因甲基化在甲状腺结节良恶性鉴别中的应用。

背景技术

甲状腺结节(Thyroid nodules)是甲状腺细胞异常增生后在甲状腺组织中形成的团块。甲状腺结节非常常见，尽管大多数甲状腺结节是良性的，但还是有一小部分甲状腺结节进展为甲状腺癌。为了更早期诊断和治疗甲状腺癌，同时降低非必要的手术，需要对甲状腺结节进行良恶性鉴别。

目前对甲状腺结节的评估主要通过超声检查(ultrasonography,US)和细针穿刺活检(fine needle aspiration biopsy,FNAB)。在甲状腺结节的诊断程序中，US是目前敏感性最高的检查方法，可测量结节的大小、确定结节的内部结构等。提示甲状腺结节为恶性的US征象包括：结节的高度大于宽度(OR＝10.15)、缺乏声晕(OR＝7.14)、微小钙化(OR＝6.76)、边界不规则(OR＝6.12)、回声减低(OR＝5.07)、实性结节(OR＝4.69)、结节内部血流丰富(OR＝3.76)等。直径＞1cm，且超声检查有恶性征象的结节再行FNAB判断结节性质。细胞学检查结果中还有高达20％的结节为不确定甲状腺结节(indeterminate thyroidnodules)，这部分结节需要结合分子检测。市面上已有Gene ExpressionClassifier和ThyroSeqv2产品，前者阳性预测值(positive predictive value,PPV)很低，只有46％；后者PPV也只有42％-77％。因此需要更精确的分子诊断工具。

DNA甲基化是表观遗传的一种机制，是真核细胞基因组常见的表观遗传学修饰，也是脊椎动物DNA在不改变DNA序列的情况下重要的自然化学修饰方式，在细胞增殖、分化、发育等方面起重要作用，与肿瘤的发生、发展关系密切。DNA甲基化在体内有着重要作用，其效应有转录抑制、染色质结构调节、X染色体失活、基因组印记等，DNA甲基化异常可以通过影响染色质结构以及癌基因和抑癌基因的表达而参与肿瘤的发生和进展。

CpG二核苷酸是哺乳动物发生DNA甲基化的最主要靶点，分布于整个染色体组。健康人基因组中，CpG岛中的CpG位点通常处于非甲基化状态，而在CpG岛外的CpG位点则通常高甲基化，这种甲基化的形式在细胞分裂的过程中能够稳定保留。当肿瘤发生时，通常抑癌基因非CpG岛区的CpG位点甲基化程度降低，而CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，导致染色质结构改变及抑癌基因表达的降低。

随着过去十几年来遗传学和表观遗传学的不断发展，越来越多的研究者认识到肿瘤的发生并不完全由遗传基因决定，表观遗传学的后天影响同样发挥重要作用。甲状腺癌中的表观遗传学改变主要体现为抑癌基因和甲状腺相关基因的异常甲基化。研究甲状腺癌的DNA甲基化可以为我们提供新的分子标志物，为早期诊断、治疗方案选择和预后评估提供可靠依据。

目前DNA甲基化检测方法有：亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing,BS)、甲基化特异的PCR法(Methylation-specific PCR,MSP)、甲基化敏感高分辨率熔解曲线法(Methylation-sensitivity High-resolution Melting,MS-HRM)和高通量测序法等。相对于其他的检测方法而言，亚硫酸氢盐测序法是DNA甲基化检测中的“金标准”，检测较为精准，但其检测灵敏度相对较低，且操作较繁琐、成本高。甲基化敏感高分辨率熔解曲线法在PCR扩增中通过观察熔解曲线的变化来判断DNA是否发生甲基化，此类方法结果分析相对复杂。高通量测序检测方法主要涉及到的成本太高，周期长，不利于临床上的推广。本领域亟需甲状腺结节良恶性鉴别的高特异性、高灵敏度试剂盒。

发明内容