[发明专利]一种siRNA靶向抑制Zwilch的研究方法及其应用

权利要求书

1.一种siRNA靶向抑制Zwilch的研究方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1胶质瘤细胞培养

人脑胶质瘤细胞系U87MG采用含有10％FBS的DMED高糖型培养基培养，培养条件为37℃，5％CO₂浓度；

步骤2慢病毒感染

选取生长状态良好的胶质瘤细胞系U87MG，将U87MG接种至六孔板中，确保细胞融合度在30％-50％之间；在MOI＝10的条件下感染慢病毒，首先对慢病毒进行适当稀释根据病毒滴度和六孔板中的细胞数计算出所需的病毒体积、HitransG病毒感染试剂的剂量，然后弃去六孔板中的培养基，加入上述慢病毒感染混合液，继续培养；12h后弃去慢病毒感染混合液，加入正常完全培养基继续培养；

步骤3Zwilch基因蛋白表达水平分析

Zwilch-siRNA表达慢病毒感染U87MG细胞后，收集生长状态良好的胶质瘤细胞U87MG及慢病毒感染的Zwilch敲减及阴性对照细胞，进行常规的Western blotting检测，以β-actin为内参，分析Zwilch基因蛋白表达量的变化；用GraphPad Prism 6分析条带的灰度值，量化蛋白表达；

步骤4细胞增殖能力分析

收集生长状态良好的胶质瘤细胞U87MG及慢病毒感染的Zwilch敲减及阴性对照细胞，加细胞悬液100μl到96孔板，边缘孔用PBS填充，每个细胞重复3个孔，接种6个相同的96孔板，每隔24小时拿出其中一块板，向各孔中加入10μl CCK-8溶液，37℃孵育4h后测定450nm各孔的OD值，连着监测6天后，将所得的OD值整理后绘制成折线图，分析各组细胞增殖能力的变化；

步骤5平板克隆实验

观察胶质瘤细胞U87MG的生长状态，选取生长状态良好的U87MG及慢病毒感染的Zwilch沉默、阴性对照细胞，接种至35mm细胞培养皿中，每皿接种200个细胞，每组3皿，每3-4d换一次液，连续培养两周；弃去培养基，用PBS清洗3遍，甲醇固定后用1％结晶紫染色15min，弃去结晶紫染色液，用PBS洗净结晶紫，然后拍照，对细胞克隆形成数进行计数，其中细胞克隆形成的标准为直径大于100μm或者细胞数大于50个；

步骤6统计分析

实验数据分析采用SPSS 22.0软件，实验中计量资料用均数±标准差表示，四组整体比较用方差分析，两两组间比较采用LSD-t检验，P0.05时认为差异有统计学意义。

2.根据权利要求1所述的siRNA靶向抑制Zwilch的研究方法，其特征在于，步骤2中，稀释条件为：用无血清DMED高糖型培养基稀释病毒，稀释后滴度为原来的1/100。

3.根据权利要求1所述的siRNA靶向抑制Zwilch的研究方法，其特征在于，步骤2中，细胞融合度为40％。

4.一种权利要求1所述的方法在制备治疗胶质瘤的药物过程中的应用。