[发明专利]一种siRNA靶向抑制Zwilch的研究方法及其应用

说明书

本发明公开了一种siRNA靶向抑制Zwilch的研究方法及其应用，构建靶向Zwilch基因的siRNA感染U87MG细胞，采用荧光显微镜、Western blotting观测感染效率及Zwilch蛋白表达的抑制效果。siRNA有效抑制Zwilch表达后，运用CCK‑8和平板克隆实验检测U87MG细胞增殖及克隆形成能力的变化。研究结果表明，Zwilch表达下调可以显著抑制U87MG细胞的增殖，证实了Zwilch在人脑胶质瘤发病中的作用以及基因治疗的潜在价值。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种siRNA靶向抑制Zwilch的研究方法及其应用，具体地说，涉及一种siRNA靶向抑制Zwilch表达对人脑胶质瘤U87MG细胞增殖的影响的研究方法与应用。

背景技术

胶质瘤是中枢神经系统最为常见的原发性肿瘤，具有发病率高、复发率高、死亡率高，以及治愈率低等特点。尽管近年来不断探索和革新手术切除以及化疗、放疗方案，但传统治疗措施在改善预后、延长患者生存期方面仍收效甚微。据统计恶性胶质瘤患者的中位生存期仅为12～15个月，而复发胶质瘤患者仅能生存3～9月。其中的主要原因是瘤细胞的异常增殖得不到有效抑制。Zwilch基因是后生动物有丝分裂检查点的基本组分，通过RZZ(ZW10/Rod/Zwilch)复合体发挥作用，能防止细胞过早退出有丝分裂，对于有丝分裂过程中动粒-微管连接装置的建立发挥着不可或缺的作用。该基因依赖细胞周期表达，在细胞的有丝分裂中发挥着重要的生理作用。

人脑胶质瘤预后不良、生存率低的两个关键因素即为肿瘤细胞的异常增殖和迁移/侵袭，这是肿瘤非常突出的生物学特性，其过程比较复杂，但归根结底系肿瘤细胞的异常有丝分裂造成。后生生物细胞的有丝分裂是一个复杂、精巧的调控过程。为保证遗传信息的平均分配，每一个姐妹染色体对上的着丝粒都分别需要与来自两极的微管连接，这一过程由纺锤体组装检验点(spindle assembly checkpoint，SAC)实时监控。SAC的信号通路主要包括四个组分：①主要成分包括Mad1/2/3、BubR1、Bub1/3等；②动粒蛋白包括RZZ复合体、Ndc80复合物等；③微管马达包括dynein、CENP-E等；④效应器包括cdc20、APC/C等。本课题侧重于对动粒蛋白中RZZ复合体的研究。该复合体主要由Rough Deal(Rod)、Zeste-white10(Zw10)和Zwilch组成。研究表明，在细胞的有丝分裂过程中RZZ复合体的作用主要有两点：①募集dynein/dynactin到着丝粒；②募集Mad1-Mad2到着丝粒并促进其与相应受体结合，以此来保证有丝分裂的正常进行。目前相关研究已经证实RZZ复合体与多种恶性肿瘤的发生密切相关。但作为一种新近发现的原癌基因，Zwilch在胶质瘤细胞的恶性增殖及浸润中究竟扮演什么样的作用，目前仍知之甚少。

发明内容

本发明的目的在于提供一种siRNA靶向抑制Zwilch的研究方法及其应用，该方法用Zwilch-siRNA慢病毒感染人脑胶质瘤细胞U87MG，观察其细胞增殖、克隆形成能力的变化，以探讨Zwilch在胶质瘤发生发展中的作用。

其技术方案如下：

一种siRNA靶向抑制Zwilch的研究方法，包括以下步骤：

步骤1胶质瘤细胞培养

人脑胶质瘤细胞系U87MG采用含有10％FBS的DMED高糖型培养基培养，培养条件为37℃，5％CO₂浓度。

步骤2慢病毒感染

选取生长状态良好的胶质瘤细胞系U87MG，将U87MG接种至六孔板中，确保细胞融合度在30％-50％之间；在MOI＝10的条件下感染慢病毒，首先对慢病毒进行适当稀释根据病毒滴度和六孔板中的细胞数计算出所需的病毒体积、HitransG病毒感染试剂的剂量，然后弃去六孔板中的培养基，加入上述慢病毒感染混合液，继续培养；12h后弃去慢病毒感染混合液，加入正常完全培养基继续培养。