[发明专利]一种产1,4-丁二醇的重组丁醇梭菌及其构建方法与应用有效
| 申请号： | 202010040929.2 | 申请日： | 2020-01-15 |
| 公开（公告）号： | CN111088209B | 公开（公告）日： | 2021-07-30 |
| 发明（设计）人： | 应汉杰;柳东;李楠;王振宇;葛世凯;曹幸园;牛欢青;陈勇 | 申请（专利权）人： | 南京工业大学 |
| 主分类号： | C12N1/21 | 分类号： | C12N1/21;C12N15/60;C12N15/74;C12P7/18;C12R1/145 |
| 代理公司： | 江苏圣典律师事务所 32237 | 代理人： | 胡建华 |
| 地址： | 210000 江*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 丁二醇 重组 丁醇 及其 构建 方法 应用 | ||
1.一种产1,4-丁二醇的重组丁醇梭菌，其特征在于，所述的重组丁醇梭菌是通过在丁醇梭菌中表达4-羟基丁酰辅酶A脱水酶构建得到的；
其中，所述的丁醇梭菌为ATCC824；
其中，所述的表达4-羟基丁酰辅酶A脱水酶是通过cbei_2100，ckl_3020，abfD，lf65-02412和ctk-c07640中的任意一种的基因片段表达；其中，所述cbei_2100，ckl_3020，abfD，lf65-02412和ctk-c07640基因片段的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示。
2.权利要求1所述的产1,4-丁二醇的重组丁醇梭菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将cbei_2100，ckl_3020，abfD，lf65-02412和ctk-c07640中的任意一种的基因片段插入到载体质粒的酶切位点后，得到重组质粒；
（2）将步骤（1）得到的重组质粒进行甲基化，得到甲基化的重组质粒；
（3）将步骤（2）得到的甲基化的重组质粒转至丙酮丁醇梭菌中，筛选即得。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的载体质粒为PSY8，其核苷酸序列如 SEQ ID NO.7所示。
4.根据权利要求1所述的产1,4-丁二醇的重组丁醇梭菌，其特征在于，所述的重组丁醇梭菌中etfA基因失活，所得重组丁醇梭菌中etfA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
5.权利要求4所述的产1,4-丁二醇的重组丁醇梭菌的构建方法，其特征在于，etfA基因失活的重组丁醇梭菌的构建方法为利用二型内含子基因敲除技术将SEQ ID NO.8所示的内含子序列插入etfA基因的第639 bp和第640 bp之间。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述的二型内含子基因敲除技术包括如下步骤：
（1）将SEQ ID NO.8所示的内含子序列构建到基因敲除质粒中，得到重组质粒；
（2）将步骤（1）得到的重组质粒转化丙酮丁醇梭菌，筛选得到etfA基因失活的菌株。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的基因敲除质粒为PMTL007C-E2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
8.权利要求1所述重组丁醇梭菌在制备1,4-丁二醇中的应用。
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