[发明专利]一种产1,4-丁二醇的重组丁醇梭菌及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种产1,4‑丁二醇的重组丁醇梭菌及其构建方法与应用，所述的重组丁醇梭菌是通过在丁醇梭菌中表达4‑羟基丁酰辅酶A脱水酶构建得到的。与现有技术相比，本发明具有如下优势：(1)相比于无法生产1,4‑丁二醇的野生菌，本发明构造的重组菌在生产1,4‑丁二醇的过程中，其产量达到66mg/L。(2)本发明进一步将丁醇梭菌中etfA基因失活，该重组菌产1,4‑丁二醇的产量进一步提高了，达到182mg/L。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种产1,4-丁二醇的重组丁醇梭菌及其构建方法与应用。

背景技术

1,4-丁二醇是一种重要的基本有机化工原料和精细化工原料，其下游衍生物很多，用途十分广泛。其衍生物是高附加值的精细化工产品，广泛用于溶剂、医药、化妆品、增塑剂、固化剂、农药，主要用于制造四氢呋喃(THF)、聚二苯二甲酸丁二醇脂(PBT)、γ-丁内酯(GBL)、N－甲基吡咯烷酮(NMP)、N－乙烯基吡咯烷酮(NVP)等。中国是全球需求增速最快的地区，预计增速为4％～6％。国外一些生产商已在规避BDO产能过剩，德国巴斯夫公司是全球最大的BDO生产商，年产能为46.7万吨。然而现在工业化生产1,4-丁二醇还是以化石燃料为主极大的耗费了资源且会对环境产负担，因而需要开发一种生物制备的方法来生产1,4-丁二醇。

现有的1,4-丁二醇的方法有两种，第一种在于利用TCA循环后的琥珀酸作为底物经过一些基因改造生产1,4-丁二醇；另有一种以木糖非磷酸化途径进行生产。第一种方法能量产出为0，还原力为1，第二种方法能量产出为1，还原力为0，其能量产出和还原力均比较低。因此，需要开发一种高能量产出，高还原力的制备1,4-丁二醇的方法路径。此外，丁醇梭菌主要用于丙酮-丁醇乙醇(ABE)发酵，现在也有应用于生产2,3-丁二醇，乙偶姻等产品中，且产量较高，应用广泛，而对相似的1,4-丁二醇上的应用极少，利用丁醇梭菌是为了构建新的能够高效产1,4-丁二醇的生物途径，从而发展成为一种的梭菌模型。

乙偶姻是合成2,3-丁二醇的前提，丙酮丁醇梭菌自身具有合成乙偶姻的基因，且流向乙偶姻的代谢步骤相对需要用巴豆酰辅酶A进行进一步合成的1,4-丁二醇来说较少，代谢支路少更易控制其代谢方向。而生产1,4丁二醇的过程中代谢支路和多余代谢产物也较多，相对更难控制代谢途径的转变，也因而更难生产。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种产1,4-丁二醇的重组丁醇梭菌。

本发明还要解决的技术问题是提供上述重组丁醇梭菌的构建方法。

本发明最后还要解决的技术问题是提供上述重组丁醇梭菌的应用。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种产1,4-丁二醇的重组丁醇梭菌，所述的重组丁醇梭菌是通过在丁醇梭菌中表达4-羟基丁酰辅酶A脱水酶构建得到的。其代谢图可见图1。图1的代谢过程可看出在丁醇梭菌中表达4羟基丁酰辅酶A脱水酶并利用巴豆酰辅酶A，是由巴豆酰辅酶A通过4HBD转化生产的1,4-丁二醇。

其中，所述的丁醇梭菌为CGMCC NO.5234或ATCC824。

其中，所述的表达4-羟基丁酰辅酶A脱水酶是通过4HBD，即cbei_2100(4HBD-1)，ckl_3020(4HBD-2)，abfD(4HBD-3)，lf65-02412(4HBD-4)和ctk-c07640(4HBD-5)中的任意一种的基因片段表达；其中，cbei_2100，ckl_3020，abfD，lf65-02412和ctk-c07640的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示。

其中，所述的重组丁醇梭菌优选导入cbei_2100(4HBD-1)，ckl_3020(4HBD-2)，abfD(4HBD-3)，lf65-02412(4HBD-4)和ctk-c07640(4HBD-5)中的任意一种的基因片段的丙酮丁醇梭菌。