[发明专利]一种梨PMEI蛋白体外表达的方法及其应用

权利要求书

1.氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的梨PMEI蛋白在促进梨花粉管及拟南芥根部生长中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的梨PMEI蛋白为采用以下方法制得的重组梨PMEI蛋白处理梨花粉管或拟南芥根部：

（1）提取梨花粉总RNA，反转录成cDNA，设计引物，以反转录生成的cDNA为模板进行PCR扩增梨PMEI基因；

（2）构建梨PMEI蛋白的大肠杆菌原核表达重组质粒；

（3）将步骤（2）中构建的重组质粒用热激法转化到大肠杆菌菌株Rosetta(DE3)中，构建梨PMEI蛋白的原核表达重组菌株；

（4）培养步骤（3）中构建的重组大肠杆菌菌株至OD₆₀₀为0.4-0.6，低温处理后加入IPTG诱导梨PMEI蛋白的表达；

（5）纯化诱导表达的梨PMEI蛋白；

（6）重组梨PMEI蛋白的鉴定。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（1）中，用于PCR扩增梨PMEI基因的正向引物为：5’-ATGGAGCTCGGTACCCTCGAGAGAGCGTCTCAATTAGTTAGGAGTGTTTG-3’，反向引物为：5’-AGCAGAGATTACCTATCTAGACTAGATATTTAATAACTGGGAAGTAAC-3’。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（1）中，PCR扩增梨PMEI基因的反应体系为：ddH₂O 19 μl，上下游引物各2.5 μl, cDNA 1μl, 2×Super Pfx MasterMix25 μl；PCR反应条件为：98 ℃预变性3 min，然后进行98 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30个循环，最后72 ℃延伸10 min。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（2）中，构建梨PMEI蛋白的原核表达重组质粒中所使用的大肠杆菌原核表达载体为pCold-TF，梨PMEI基因插入的酶切位点为Xho I和Xba I位点。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（4）中，所述的低温处理为于冰上静置5min，再于15 ℃静置40分钟，所述诱导剂IPTG的终浓度为0.5 mmol/L，所述诱导表达的条件为15 ℃，时间为24小时。

7.根据权利要求2或6所述的应用，其特征在于，步骤（4）中，诱导梨PMEI蛋白表达的详细过程为：将梨PMEI蛋白的大肠杆菌原核表达重组载体按照1:50的比例接种到100 ml LB液体培养基中，于37 ℃、220 rpm震荡培养过夜，再按1:50的比例转接到300 ml LB液体培养基中，于37 ℃、220 rpm震荡培养至菌液OD₆₀₀为0.4-0.6，迅速于冰上静置5分钟，再于15℃静置40分钟；加入终浓度为0.5 mmol/L的诱导剂IPTG，15 ℃、220 rpm震荡培养,诱导表达24小时；

其中，所述LB液体培养基中含有100 μg/ml氨苄青霉素。