[发明专利]一种梨PMEI蛋白体外表达的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种梨PMEI蛋白的体外表达纯化方法及其应用。通过设计引物克隆梨PMEI基因；构建大肠杆菌重组表达质粒PMEI‑pCold‑TF；将构建的重组表达质粒PMEI‑pCold‑TF转化入大肠杆菌Rosetta(DE3)中，构建梨PMEI蛋白重组表达菌株；对重组菌株进行蛋白诱导表达，并用镍柱亲和层析法纯化重组梨PMEI蛋白；之后，用获得的重组梨PMEI蛋白处理梨花粉管及拟南芥根部。通过本发明的方法，实现了梨PMEI蛋白的首次体外表达及纯化，表达效率高，纯化蛋白稳定存在且纯度完全可以满足相关实验的需要；通过重组梨PMEI蛋白对梨花粉管和拟南芥根部的处理，促进了梨花粉管和拟南芥根部的生长。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种梨PMEI蛋白体外表达的方法及其应用，具体涉及从梨花粉中克隆并纯化了一种梨PMEI蛋白，分别用该蛋白处理梨花粉管及拟南芥根部，促进了梨花粉管及拟南芥根部的生长。

背景技术

果胶是双子叶植物和除禾本科外的单子叶植物初生细胞壁的主要组成成分，也是花粉壁和花粉管壁的主要组成成分。在植物生长发育的过程中，果胶的降解和修饰需要一系列酶的参与，其中，果胶甲酯酶(pectin mthylesterases,PMEs)是果胶降解和代谢过程中一类重要的水解酶，使得甲酯化的果胶去甲酯化，从而调节胞壁的硬度和弹性。果胶甲酯酶抑制子(pectin mthylesterase inhibitors,PMEIs)是一种调控PME活性的蛋白质，能够与PME形成可逆的1:1非共价复合体，通过覆盖活性位点来抑制PME的活性。PMEI对PME的抑制作用调控了果胶的甲酯化程度，从而对细胞壁力学产生了影响。研究表明，PMEI在种子萌发、下胚轴伸长、花粉萌发和花粉管生长、果实成熟，以及应对各种生物及非生物胁迫中发挥了不可或缺的作用。分离纯化PMEI蛋白将促进对其生物学功能及作用机制的进一步研究。PMEI广泛存在于植物的各类组织和生长阶段中，但分离纯化天然的PMEI蛋白难度大，且化学合成PMEI的成本高。所以，利用基因工程技术制备重组PMEI蛋白是解决上述问题的一个有效途径。

基因工程技术制备重组蛋白的方法获得了广泛的应用。至今为止，人们已构建了多种蛋白表达系统，如原核表达系统、真核表达系统、无细胞表达系统等。大肠杆菌表达系统是最常用的原核表达系统，具有遗传背景简单、生化特性明确、生长速度快、经济成本低、表达水平高、产物易于分离纯化及便于工厂化生产等优点。自构建以来，众多重组蛋白已经通过大肠杆菌表达系统制备出来。利用基因工程技术纯化出的PMEI蛋白去处理梨花粉管及拟南芥的根部，可以观测到其对于梨花粉管及拟南芥的根部生长的促进效用。

发明内容

本发明目的是提供一种低成本、高产率、易纯化的梨PMEI蛋白体外表达的制备方法。

本发明另一目的是提供梨PMEI蛋白在促进梨花粉管及拟南芥根部生长中的应用。

本发明的目的可以采用以下技术方案来实现：

一种梨PMEI蛋白体外表达的方法，包括以下步骤：

(1)提取梨花粉总RNA，反转录成cDNA，设计引物以反转录生成的cDNA为模板进行PCR扩增梨PMEI基因；

(2)构建梨PMEI蛋白的大肠杆菌原核表达重组质粒；

(3)将步骤(2)中构建的重组质粒用热激法转化到大肠杆菌菌株Rosetta(DE3)中，构建梨PMEI蛋白的原核表达重组菌株；

(4)培养步骤(3)中构建的重组大肠杆菌菌株至OD₆₀₀为0.4-0.6，低温处理后加入IPTG诱导梨PMEI蛋白的表达；

(5)纯化诱导表达的梨PMEI蛋白；

(6)重组梨PMEI蛋白的鉴定。