[发明专利]一种冬生疫霉的特异性检测新靶标Phibe_s00003g00002.1及其应用

说明书

本发明公开了一种冬生疫霉的检测新靶标Phibe_s00003g00002.1及其专用检测引物和检测方法，该检测靶标Phibe_s00003g00002.1的DNA序列如SEQ ID NO：1所示，蛋白序列如SEQ ID NO：2所示。同时，公开了特异性检测靶标Phibe_s00003g00002.1的RPA检测技术的特异性引物及探针组合，其正向引物序列如SEQ ID NO：3所示，反向引物序列如SEQ ID NO：4所示，探针序列如SEQ ID NO：5所示。本发明发现了新的检测靶标，且基于该靶标的快速检测方法准确性高、特异性强、操作方便、实用性好、实现了恒温扩增，同时本发明设计的引物及探针组合用于RPA‑LFD检测技术，其特异性强，灵敏度高，为冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)的检测提供了新的技术平台。

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种冬生疫霉的特异性新检测靶标Phibe_s00003g00002.1及其应用。

背景技术

疫霉(Phytophthora)，任何植物一旦被它侵染就会在劫难逃，损伤严重。所以，拉丁文Phytophthora被描述为：植物的毁坏者。Phyto，在原来的希腊语中是植物的意思，phthora则是破坏的意思。疫霉(Phytophthora)正式报道有100多个种,许多疫霉都有严重危害农业生产安全的记录，可以说个个是农作物的毁坏者，轻则造成缺苗断垄，重则造成严重的产量损失，甚至绝产。因此，防止外来有害检疫性疫霉菌传入我国具有重要意义。我国进境检疫性名录中包括冬生疫霉Phytophthora hibernalis、丁香疫霉P.syringae、栎树猝死病菌P.ramorum、大豆疫霉病菌P.sojae、栗疫霉黑水病菌P.cambivora、马铃薯疫霉绯腐病菌P.erythroseptica、草莓疫霉红心病菌P.fragariae、树莓疫霉根腐病菌P.rubi、雪松疫霉根腐病菌P.lateralis、苜蓿疫霉根腐病菌P.medicaginis、菜豆疫霉病菌P.phaseoli共11种疫霉菌。柑橘是一种性喜温暖湿润气候的经济型水果，在全世界138个国家(地区)有种植，产量和面积均占百果之首^[1]。我国是柑橘生产大国，柑橘产业在我国农业经济发展中占有重要地位，从2007年起，我国已经成为全球柑橘年产量最大的国家。1925年，首次在澳大利亚西部柑橘果实上发现冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)。目前冬生疫霉主要寄主为柑橘、苹果、番茄等植物，可引发水果褐腐病、枝枯病和叶枯病，导致果实变褐、腐烂、直至植株死亡。该病菌首次在澳大利亚西部的柑桔果实上发现，目前在欧洲的绝大部分国家，以色列、土耳其、美国加州、澳大利亚、新西兰、巴西等国家和地区均有分布，尤其以意大利、葡萄牙等国柑橘受害严重。2015年，上海口岸从进口美国脐橙和柚子中，截获冬生疫霉。目前中国尚未有冬生疫霉(P.hibernalis)分布的报道。传统的冬生疫霉菌的分类鉴定主要是基于形态学特征、致病性测定、生理生化特征等。传统的分离疫霉菌的方法采用诱捕法从土壤、灌溉水和植物材料中分离疫霉菌。为了提高诱捕效果，可在土壤溶液中加入少量抗生素和杀菌剂抑制杂菌生长。适用于做诱饵的植物材料因不同疫霉菌也有所不同，松针适合用于诱捕冬生疫霉菌。传统方法在冬生疫霉菌检测中发挥了重要作用，但是费时费力而且要求操作者具备专业的疫霉菌分离、形态学鉴定知识和丰富的经验；同时传统分类鉴定方法耗时长、灵敏度低、易受人为及环境等诸多因素的干扰，不能在病害潜伏期和发病初期做出诊断，很难对病害发生进行及时的监测和有效控制。随着分子生物学的发展，PCR技术为植物病原诊断提供了快速、灵敏、准确的优势，在病原物的鉴定和检测中的地位越来越重要。近年来，一些疫霉菌的PCR检测方法被开发出来。这些方法中设计的引物的来源主要都是转录间隔区(ITS)或者elicitin基因。这些区域或者基因在基因组中都是高拷贝的，所以很容易被检测到。但是越来越多的研究发现，部分疫霉种的ITS序列差异很小，以此为靶标设计的引物难以将不同种区分开来。