[发明专利]一种丹参P450突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种丹参P450突变体及其应用。本发明通过定向改造CYP76AH1，对其催化效率进行优化，获得功能整合P450突变体，使原本需要CYP76AH1与CYP76AH3两个蛋白协同作用完成的反应路径通过本发明中的CYP76AH1突变体可以直接催化完成，CYP76AH1突变体的构建可以缩短反应过程中底物运输路径，在一个蛋白口袋内高效完成多步反应，从而提高底物利用效率，提高目标化合物的产量。本发明中针对不同产物转化效率提高的CYP76AH1突变体为后续丹参酮生物合成途径解析提供底物及底盘菌，对丹参酮生物合成途径全解析及构建高产丹参酮类化合物酵母工程菌具有重要指导意义。

技术领域

本发明涉及一种丹参P450突变体及其应用。

背景技术

在药用天然产物的生物催化和合成生物学研究中，P450的催化效率一直是国际合成生物学研究中的难点问题。例如，青蒿酸的合成生物学中存在P450的催化效率对终产物的产量限制的问题，在CYP71AV1和CPR1表达后，青蒿酸生产工程酵母Y285培养产物的产量较上一步紫穗槐二烯的产量显着降低。Paddon等认为，Y285中倍半萜产物的催化活性降低和产量减少可能是由催化氧化紫穗槐二烯的细胞色素P450的效率过低引起的。

丹参酮类化合物生物合成途径中含有多个P450，申请人所在实验室结合组学技术、生物信息学和合成生物学手段克隆并验证了P450酶CYP76AH1和CYP76AH3的功能(图1)。由于P450催化功能的杂泛性，导致丹参酮类化合物生物合成途径分成两个分支，产生了分别在铁锈醇和柳杉酚的基础上进行了7位和11位修饰的两类化合物。在通过P450酶直接催化和通过含有野生型CYP76AH1、CYP76AH3基因的酵母工程菌株获取丹参酮类前体化合物的实验中，P450的催化效率一直是亟待解决的重要难题，CYP76AH1、CYP76AH3两个P450是丹参酮类化合物生物合成研究的关键组件和限速步骤。

发明内容

本发明的目的是提供一种丹参P450突变体及其应用。

第一方面，本发明首先保护蛋白质，是将序列表中序列2所示的蛋白质第301位氨基酸残基、第306位氨基酸残基、第395位氨基酸残基和第479位氨基酸残基中的至少一个进行突变得到的。

所述蛋白质具体可为如下(a1)-(a15)中的任一种：

(a1)将序列表中序列2所示的蛋白质进行如下点突变得到的蛋白质：第301位氨基酸残基由D突变为E，第479位氨基酸残基由V突变为F；

(a2)将序列表中序列2所示的蛋白质进行如下点突变得到的蛋白质：第301位氨基酸残基由D突变为E，第395位氨基酸残基由I突变为M；

(a3)将序列表中序列2所示的蛋白质进行如下点突变得到的蛋白质：第306位氨基酸残基由S突变为E；

(a4)将序列表中序列2所示的蛋白质进行如下点突变得到的蛋白质：第301位氨基酸残基由D突变为E，第395位氨基酸残基由I突变为M，第479位氨基酸残基由V突变为F；

(a5)将序列表中序列2所示的蛋白质进行如下点突变得到的蛋白质：第479位氨基酸残基由V突变为F；

(a6)将序列表中序列2所示的蛋白质进行如下点突变得到的蛋白质：第301位氨基酸残基由D突变为E；

(a7)将序列表中序列2所示的蛋白质进行如下点突变得到的蛋白质：第306位氨基酸残基由S突变为E，第479位氨基酸残基由V突变为F；

(a8)将序列表中序列2所示的蛋白质进行如下点突变得到的蛋白质：第395位氨基酸残基由I突变为M，第479位氨基酸残基由V突变为F；

(a9)将序列表中序列2所示的蛋白质进行如下点突变得到的蛋白质：第306位氨基酸残基由S突变为E，第395位氨基酸残基由I突变为M；