[发明专利]副溶血弧菌的核酸快速恒温检测方法及应用

说明书

本发明公开了一种针对副溶血弧菌的快速恒温检测方法、引物组、试剂盒及应用。所述方法为：从待测样品中提取基因组DNA；以所述基因组DNA为模板，以能扩增副溶血弧菌特异性序列的引物组为引物，在酶反应体系下进行恒温扩增反应；通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在副溶血弧菌。本发明检测方法具有高灵敏度和高特异性，检测时间短，结果判定简单，操作便捷，成本低，具广泛应用前景。

本申请是2016年8月30日提交的、申请号为201610780447.4、发明名称为：“快速恒温检测副溶血弧菌的方法、引物及应用”的中国发明专利申请的分案申请；该母案申请要求申请日为2015年9月2日、申请号为201510556917.4、发明名称为“快速恒温检测阪崎克罗诺杆菌的方法、引物及试剂盒”的中国发明专利申请的优先权。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种快速恒温检测副溶血弧菌的方法、引物及试剂盒。

背景技术

副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是一种革兰氏阴性嗜盐细菌，广泛分布于江河、海洋及热带和温带沿海地区，主要寄生于浮游生物、鱼、虾蟹、贝类等水产品中，直接或间接食用被该菌污染的食品会引发腹泻、肠痉挛、恶心、呕吐、发烧等典型胃肠炎反应，严重者可引起败血症。副溶血弧菌发病呈世界性分布，尤其在沿海地区发病率较高，在我国沿海城市副溶血性弧菌引起的食物中毒在细菌性食物中毒事件中所占比例已经超过沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌等，位居首位。因此，对于该菌的检测和预防都具有重要意义。

目前，国内外针对副溶血弧菌的检测方法仍以常规培养方法作为标准，其检测周期较长(达5-7天)，操作相对复杂，检测效率较低，难以满足现代社会对于食源性致病菌检测过程高通量、高灵敏度、高特异性、快速、便捷的要求。近年来随着核酸分子检测技术的发展，以特异性基因为靶标建立的PCR技术已经成功应用于副溶血弧菌的检测，具有灵敏度高，检测时间短等优点，但该方法必须配备专门的仪器设备，并且需要专业的操作人员。因此，并不适合广泛应用于基层检测部门尤其是企业生产线内部进行的实时实地检测。为确保食品安全，急需快速、简单、准确的方法来检测食品中的副溶血性弧菌。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近年来发展起来的一种新型恒温核酸扩增方法，该法针对靶序列的6个区域设计4条特异性引物(包括上下游外引物F3和B3以及上下游内引物FIP和BIP，其中FIP由F1C和F2组成，BIP由B1C和B2组成)，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件保温约60min，即可完成核酸扩增反应，产生肉眼可见的反应副产物-白色焦磷酸镁沉淀(见文献Notomi T,OkayamaH,Masubuchi H,Yonekawa T,Watanabe K,Amino N,Hase T.Loop-mediated isothermalamplification of DNA,Nucleic Acids Research,2000Jun 15；28(12):E63)。该技术具有不需要PCR仪或荧光定量PCR仪、恒温下即可完成，肉眼即可判断反应结果，以及灵敏度高、特异性强、反应时间短、操作便捷、成本低等优点。