[发明专利]一种检测组织蛋白酶B的生物传感器及其检测方法和应用

说明书

本发明提供一种检测组织蛋白酶B的生物传感器及其检测方法和应用，属于检测分析技术领域。本发明中的生物传感器至少多肽‑DNA偶联物，DNA模板1和DNA模板2。本发明将含有氨基酸残基的第一引物DNA转化成不含氨基酸残基的新引物DNA，可以完全消除核酸扩增过程中的空间位阻效应，以增加扩增反应效率。同时，多个链置换反应的进行及核糖核酸酶H的循环消化作用可进一步放大荧光信号，因此可实现对组织蛋白酶B活性的超灵敏检测，具有良好的实际应用之价值。

技术领域

本发明属于检测分析技术领域，具体涉及一种检测组织蛋白酶B的生 物传感器及其检测方法和应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解， 而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技 术人员所公知的现有技术。

半胱氨酸组织蛋白酶是一类位于胞内溶酶体泡内的蛋白酶，其功能是介 导蛋白质的大量溶解。半胱氨酸组织蛋白酶主要根据不同的催化中心分为组 织蛋白酶B、C、F、H、L、K、O、S、V、W、X等11种，在抗原呈递和骨 吸收中发挥重要作用。组织蛋白酶B可裂解特异性肽序列，使细胞粘附蛋白 失活，激活其他蛋白酶(如层粘连蛋白)，降解细胞外基质，释放实体瘤转 移细胞，使癌细胞侵袭转移。组织蛋白酶B在多种癌症中过表达，如喉癌、 甲状腺癌、口腔癌、乳腺癌和结肠直肠癌，组织蛋白酶B正成为一种有前途 的肿瘤生物标志物，其浓度和分布可用于指导癌症的诊断和合适的抗癌药物 的选择。因此，准确、灵敏地检测组织蛋白酶B对于早期癌症的诊断和治疗 至关重要。

到目前为止，组织蛋白酶B的检测方法多种多样，主要分为亲和法和活 性法。酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫组化法可以根据组织蛋白酶B与抗 原的亲和力检测组织蛋白酶B的总浓度，酶联免疫吸附法已被广泛用于检测 组织蛋白酶B在血清、尿液和组织裂解液中的浓度。但这些检测是耗时的， 需要特定的抗体。活性测定法可以检测蛋白酶的活性，而不是检测蛋白酶的 浓度，它更贴近生物学过程，能反映靶标的真实生物学功能，在癌症诊断中 特别有用。采用紫外分光光度法对设计的多肽底物进行催化裂解，检测组织 蛋白酶B的蛋白水解活性，筛选组织蛋白酶B的抑制作用。但该方法耗时长、 样品消耗量大、自动化程度低。电化学检测技术因其易于微型化、简单的直 接电子读出、低成本和利用电极阵列同时检测多个蛋白酶的能力而受到关 注，因此，它有可能成为一种疾病诊断、治疗监测和药物筛选的方法。然而， 这种方法对于研究复杂癌细胞裂解物或组织裂解物中的蛋白酶非常有限。近 年来，基于荧光共振能量转移的蛋白酶传感器被开发出来用于检测组织蛋白 酶B的活性，其中荧光染料和淬灭标记多肽被水解成分离片段后都会发出强 烈的荧光。但这些方法需要设计复杂的荧光共振能量转移染料对，且灵敏度 较差。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种检测组织蛋白酶B的生物传感 器及其检测方法和应用。本发明通过磁珠分离辅助多肽-DNA共轭物与等温 多路循环信号放大相结合来实现，将DNA聚合酶介导的链延长与核酸酶介 导的单链刻痕相结合，基于多链置换反应的循环信号扩增具有扩增效率高、 反应温度等温、扩增动力学快等优点。利用循环信号放大，磁珠分离效率高， 以及核糖核酸酶H(RNase H)驱动消化的高特异性，可实现对组织蛋白酶 B活性的超灵敏检测，因此具有良好的实际应用之价值。

为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明的第一个方面，提供一种检测组织蛋白酶B的生物传感器，所 述生物传感器至少包括多肽-DNA偶联物，DNA模板1和DNA模板2；

其中，

所述多肽-DNA偶联物含有组织蛋白酶B的生物素化肽底物，其中肽底 物C端修饰有生物素，肽底物N端与DNA 5'端连接；多肽-DNA偶联物的 DNA部分作为核酸扩增反应的引物；

所述DNA模板1包含三个主要区域X*-Y*-Z*；

所述DNA模板2包含三个主要区域Z*-Y*-X*；