[发明专利]一种检测氟虫腈及其代谢物的胶体金试纸条及其制备方法有效
申请号: | 202010042620.7 | 申请日: | 2020-01-15 |
公开(公告)号: | CN111187346B | 公开(公告)日: | 2023-05-05 |
发明(设计)人: | 周兴华;张彩芹;张勋;张涛;肖香;王云 | 申请(专利权)人: | 江苏大学 |
主分类号: | C07K14/765 | 分类号: | C07K14/765;C07K16/44;G01N33/577;G01N33/531;C07D231/44 |
代理公司: | 暂无信息 | 代理人: | 暂无信息 |
地址: | 212013 江*** | 国省代码: | 江苏;32 |
权利要求书: | 查看更多 | 说明书: | 查看更多 |
摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 检测 氟虫腈 及其 代谢物 胶体 试纸 制备 方法 | ||
1.一种检测氟虫腈及其代谢物的胶体金试纸条制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
半抗原的制备:将氟虫腈通过酸水解法并加入乙酸,引入羧基,制备得到半抗原,所述半抗原的制备具体为:
将氟虫腈溶于浓硫酸、乙酸和水中,加热回流,然后滴加氢氧化钠水溶液,直到pH达到碱性,加纯水溶解沉淀物,用正己烷洗涤水溶液,分液酸化水层溶液,直到pH到酸性,然后用乙酸乙酯萃取,合并有机相,用饱和的盐水洗涤,经无水硫酸钠干燥,减压蒸发,过硅胶柱,得到白色固体,即为半抗原;所述浓硫酸的质量分数为98%;所述氟虫腈、浓硫酸、乙酸、水用量比为300~500mg:1~4mL:1~3mL:1~2mL;所述纯水和沉淀物的用量比为2~3 mL:200~600mg;
免疫原和包被原的制备:将所述半抗原通过活化酯法偶联蛋白质分别制备免疫原和包被原,所述免疫原和包被原的制备具体为:
半抗原的活化:将所述半抗原溶于二甲基甲酰胺DMF中,向其中加入N-羟基琥珀酰亚胺NHS和1-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC,并将混合物搅拌活化,得到已活化的半抗原;所述半抗原、DMF、NHS和EDC的用量比为2~4mg:0.5~1mL:1~4 mg:2~7 mg;所述搅拌活化时间为6~8h;
免疫原的制备:将牛血清白蛋白BSA充分地溶解在碳酸盐缓冲液CBS中,得到BSA溶液,在磁力搅拌下将已活化的半抗原溶液逐滴地加到BSA溶液中,将混合物搅拌反应,得到免疫原,免疫原用磷酸盐缓冲PBS透析;
包被原的制备:将鸡卵清白蛋白OVA充分地溶解在碳酸盐缓冲液CBS中,得到OVA质溶液,在磁力搅拌下将已活化的半抗原溶液逐滴地加到OVA溶液中,将混合物搅拌反应,得到包被原,包被原用磷酸盐缓冲PBS透析;
单克隆抗体的制备:用所述免疫原制备单克隆抗体,用所述包被原通过ic-ELISA检测单
克隆抗体的灵敏度和特异性,得到抗氟虫腈及其代谢物的单克隆抗体;
金标抗体的制备:将所述单克隆抗体用胶体金标记制备得到金标抗体;
胶体金试纸条的制备:用氟虫腈偶联蛋白质的包被原在硝酸纤维素膜上制作检测线,以二抗在硝酸纤维素膜上制作质控线,然后组装成试纸条。
2.根据权利要求1所述的检测氟虫腈及其代谢物的胶体金试纸条制备方法,其特征在于,所述免疫原的制备过程中,所述BSA和CBS缓冲液的用量比为7~15mg:3~5 mL;
所述包被原的制备过程中,所述OVA和CBS缓冲液的用量比为5~10mg:2~5 mL;
所述已活化的半抗原溶液中的半抗原与BSA溶液中的蛋白质的摩尔比,以及已活化的半抗原溶液中的半抗原与OVA溶液中的蛋白质的摩尔比均为20:1~40:1;
所述搅拌反应的温度为4℃,搅拌反应的时间为12~18 h;
所述PBS缓冲液透析时的温度为4℃,时间为36~78 h。
3.根据权利要求1所述的检测氟虫腈及其代谢物的胶体金试纸条制备方法,其特征在于,所述金标抗体的制备具体为:
取纯水加热沸腾,在搅拌条件下加入氯金酸溶液,再加入柠檬酸三钠溶液,得到胶体金溶液;
取胶体金溶液,加入硼酸缓冲液,充分混匀之后逐滴加入所述单克隆抗体溶液反应,然后逐滴加入10% BSA封闭,得到混合溶液;
将所述混合溶液离心,弃去上清液,得到沉淀物,将所述沉淀物溶于重悬液中,得到金标抗体。
4.根据权利要求3所述的检测氟虫腈及其代谢物的胶体金试纸条制备方法,其特征在于,所述纯水、氯金酸溶液与柠檬酸三钠溶液的用量比500~900 mL:1~2mL:1~3 mL;
所述胶体金溶液、单克隆抗体溶液、硼酸缓冲液和10%BSA用量比是3~6mL:18~48μg:300~600μL:200~800μL;
所述沉淀物和重悬液的用量比为0.1~1mg:300~500μL。
该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息,商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于江苏大学,未经江苏大学许可,擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作,请联系【客服】
本文链接:http://www.vipzhuanli.com/pat/books/202010042620.7/1.html,转载请声明来源钻瓜专利网。