[发明专利]一种非动物源低分子量肝素及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种非动物源低分子量肝素的制备方法，所述非动物源低分子量肝素的结构式如下：

其中，x，y为0~9之间的整数，且x+y为2~9之间的整数，所述非动物源低分子量肝素的重均分子量为3000Da~8000Da，其水解产物的不饱和双糖主要包括ΔU-GlcNAc、ΔU-GlcNS、ΔU-GlcNS6S、ΔU2S-GlcNS、ΔU2S-GlcNS6S；

其特征在于，包括步骤如下：

（1）以胞外多糖K5CPS为底物，将胞外多糖K5CPS的N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）残基经化学法N-脱乙酰化/N-硫酸化修饰成为N-硫酸化葡糖胺（GlcNS），得到中间产物1；

（2）将中间产物1经肝素酶Ⅲ部分解聚得到低分子量的中间产物2，所述中间产物2的重均分子量为2000Da~5000Da；

（3）通过肝素C-5差向异构化酶（C5-epi）和肝素2-O-硫酸基转移酶（2OST）共同催化修饰，使中间产物2的葡糖醛酸（GlcA）残基一步转变为2-O-硫酸化艾杜糖醛酸（IdoA2S），得到中间产物3；

（4）由肝素6-O-硫酸基转移酶（6OST）催化，使中间产物3的葡糖胺（GlcNS）残基发生6-O-硫酸化修饰（GlcNS6S），得到中间产物4；

（5）由肝素3-O-硫酸基转移酶（3OST）催化，使中间产物4的葡糖胺发生3-O-硫酸化修饰（GlcNS6S3S），得到具有抗FXa和FIIa活性的非动物源低分子量肝素naLMWH。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述胞外多糖K5CPS来源于天然微生物大肠杆菌K5、多杀性巴氏杆菌、副鸡禽杆菌、或者代谢产生胞外多糖K5CPS的基因工程菌株；所述胞外多糖K5CPS的重均分子量＞10000Da。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述化学法N-脱乙酰化/N-硫酸化的具体方法为：

将胞外多糖K5CPS溶解于碱性溶液中，水浴加热处理以实现胞外多糖K5CPS的N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）残基的N-脱乙酰化，然后调节pH至7.0~8.0，以三氧化硫-三甲胺混合物为硫酸基供体对葡糖胺残基进行N-硫酸化定点修饰，制得中间产物1。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，满足以下条件之一项或多项：

i. 所述碱性溶液为2M氢氧化钠溶液；

ii. 所述水浴加热处理为55~65℃下反应5~10h；

iii. 所述三氧化硫-三甲胺混合物的加入量与K5CPS的质量比不低于3∶1；

iv. 所述N-硫酸化定点修饰的反应条件为45~50℃下反应20~30h。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述肝素酶Ⅲ部分解聚的具体方法为：

将中间产物1与肝素酶III在缓冲溶液中混合，恒温水浴反应使中间产物1部分解聚，反应液分离纯化后得到低分子量的中间产物2。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述肝素酶Ⅲ部分解聚的具体方法满足以下条件之一项或多项：

i. 所述缓冲溶液的组分为50mM Tris-HCl，10mM CaCl₂，溶剂为水，pH为7.0；

ii. 所述中间产物1在缓冲溶液中的浓度为0.5~5.0 mg/mL；

iii. 所述肝素酶III在缓冲溶液中的浓度为1.0~10.0 mIU/mL；

iv. 所述恒温水浴反应的条件为20~37℃反应30~60min。